果树实生树童期长一直以来是资源利用和育种的障碍,许多学者从形态、生理、内含生化物质、激素等方面进行探索,以便搞清楚童期机理并发现缩短童期的方法,在这方面取得了不少成果。但是以往的研究在组织形态和生理水平上无法区分某因素究竟是对成花产生了影响还是对阶段转变发生了作用。因此,到目前为止,多年生木本被子植物阶段转变的生理和分子机制仍不十分清楚。本试验以5年生苹果杂种实生树(‘红玉’ב金冠’)为试材,首先利用SDS-PAGE技术确定特异蛋白质的存在;之后通过双向凝胶电泳(2-DE)和MALDI-TOF MS相结合的方法对苹果实生树童期、成年营养生长期和生殖生长期叶片蛋白质进行分离和鉴定,直接筛选、分离童期和成年营养生长期及生殖生长期的特异蛋白质;利用酶联免疫方法(ELISA)和免疫组织化学法(IHC)及RT-PCR方法对特异蛋白质进行验证及节位定位,以期发现与阶段转变相关的特异蛋白质。将有可能从蛋白质水平揭示阶段转变的生理和分子机制,对进一步认识多年生木本被子植物的个体发育具有重要的理论意义,在缩短育种周期,提高育种效率上具有重大的实践意义。研究结果如下:1.利用SDS-PAGE技术分析了6株苹果实生树叶片中蛋白质随节位升高的动态变化。随节位升高蛋白质带发生变化,共发现了3条阶段转变特异蛋白质带,分子量分别为55 kD、19 kD和17 kD。其中55 kD蛋白质表现为定性变化,有5株实生树在36～75节出现,到101～126节消失;19 kD蛋白质在实生树低节位含量高,在86～100节之后含量突然降低;17 kD蛋白质在实生树低节位含量低,随着植株的发育蛋白质在36～50节含量突然增加并保持稳定,到91～105节后含量突然下降。认为这3种蛋白质可能是苹果实生树阶段转变的特异蛋白质。2.利用改良的Tris-HCl法探索了一种可获得背景清晰、分辨率高、重复性好的苹果叶片双向电泳图谱,利用考马斯亮蓝显色可检测到455个蛋白质斑点。该方法适于苹果叶片蛋白质样品制备,可用于苹果叶片蛋白质组学研究。3.通过2-DE图谱分析,苹果实生树童期、成年营养生长期和生殖生长期叶片蛋白质表达模式存在差异,共检测到72个差异表达的蛋白质点,分子量主要分布在20～60kD,等电点约在4～8范围内。在不同的发育时期,不同的蛋白质点表现出上调或下调作用,同时发现特异蛋白质表达,即某些蛋白质在某一特定时期出现或消失。有5个蛋白质点只在童期叶片组织中出现,17个蛋白质点只在营养生长期可以检测到,1个蛋白质点只在生殖生长期表达,而在其它两个时期不表达。同时,有12个蛋白质点在童期和营养生长期同时表达,11个蛋白质点在营养生长期和生殖生长期同时表达。14个蛋白质点表现出上调作用,12个蛋白质点表现出下调作用。对所有差异表达的蛋白质点进行MALDI-TOF MS鉴定,根据得到的肽质量指纹图谱(PMF)检索,鉴定了其中的62个蛋白质点(16个蛋白质点为未知蛋白质),与21种蛋白质相匹配。根据它们的功能,大致可分为6类:Ⅰ与光合作用相关的蛋白质;Ⅱ与代谢相关的蛋白质;Ⅲ参与蛋白质合成;Ⅳ信号转导分子;Ⅴ骨架蛋白质;Ⅵ诱导胁迫蛋白质。在鉴定的苹果叶片蛋白质中,大部分都与能量合成、调节及代谢有关。与光合作用相关的酶在苹果叶片2-DE图谱中占主导地位,23个蛋白质点与光合作用有关,比例大约为42%,而且21个蛋白质点为RuBisCO。认为这21种差异表达的蛋白质可能是苹果实生树阶段转变相关的特异蛋白质。4.由于没有相应苹果属的DNA或蛋白质数据库的支持,大约26%(16/62)的蛋白质点被鉴定为未知蛋白质。为使未知蛋白质进一步得到鉴定,对16个未知蛋白质点进行随机序列测定(de novo sequenceing peptide),其中5个蛋白质点得到鉴定。分别是:蛋白质点5162(37.43kD/pI4.78)和1900(37.58kD/pI4.80)同时被鉴定为β-1,3葡聚糖酶,该蛋白质在营养生长期和生殖生长期表达,而在童期组织中检测不到该蛋白质的表达。蛋白质点3267(27.86kD/pI5.46)和2251(44.11kD/pI6.98)分别被认为是叶绿体内的叶绿素α/b结合蛋白质和光系统Ⅱ稳定因子HCF136,它们只在童期叶片中表达,而在营养生长期和生殖生长期均不表达。蛋白质点1800(41.01kD/7.81)与推断的mRNA结合蛋白质相匹配,为营养生长期相关的特异蛋白质,该蛋白质只在营养生长期可以检测到。5.采用酶联免疫方法(ELISA)分析了质谱鉴定后的2491号蛋白质点(丝氨酸羟甲基转移酶,SHMT)在实生树童期、营养生长期和生殖生长期的的表达变化。结果表明,SHMT在3个不同的生长时期表达存在显著差异。利用免疫组织化学方法(IHC)对SHMT的节位定位表明,SHMT在实生树‘02-17-115’叶片中开始出现的节位为106～110节,消失的节位为126～130节,在106～121节SHMT呈阳性反应。在其它节位均表现阴性反应,该蛋白质只在营养生长期表现出活性,与2-DE的结果相吻合。SHMT在实生树‘02-16-116’叶片中出现的节位是101～105节,消失的节位在121～125节。再一次印证了2-DE的结果。6.RT-PCR对编码mRNA进行定位,认为S6PDH、14-3-3 family protein、Majorallergen Mal dl为阳性鉴定结果。S6PDH在实生树‘02-17-115’出现的节位是111～120节,消失的节位在121～125节;编码S6PDH的mRNA在实生树出现的节位是81～85节,消失的节位是116～120节;mRNA出现的节位早于其编码的蛋白质出现的节位,而S6PDH消失的节位比mRNA消失的节位晚一个样品节位。编码14-3-3 family protein的mRNA在实生树‘02-17-115’童期和营养生长期均表达,在116～120节不再表达;14-3-3 family protein在实生树童期和营养生长期都可以检测到,从121-125节开始消失。蛋白质消失的节位落后于mRNA消失的节位。Major allergen Mal dl蛋白质在实生树‘02-17-115’童期和营养生长期表达,从121～125节开始消失。编码该蛋白质的mRNA在童期和营养生长期表达,从121～125节开始mRNA不再表达,mRNA和其编码的蛋白质消失的节位一致。