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禽流感(Avian influenza, AI)全名是鸟禽类流行性感冒,是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的禽类重要传染病之一,自从1878年首次在意大利报道以来,给世界养殖业造成了巨大的损失。同时高致病禽流感(HPAI)除了感染鸟禽外,已经跨越物种障碍感染猪、犬、甚至人类。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后,此病才引起全世界卫生组织的高度关注。其后,本病一直在亚洲地区零星爆发,但从2003年12月开始,禽流感已在世界各地均有爆发,并造成多人死亡。所以,寻求一种能够迅速生产、廉价、高效的新型流感疫苗对于禽流感的防控具有重要的意义。本研究以H5N1亚型禽流感病毒A/Chicken/ZF/1/2011(H5N1)的cDNA为模板,利用带有特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,一方面将HA基因直接连到pShuttle-CMV腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HA;另一方面将HA基因亚克隆到质粒pCAGGS中,再次将含HA基因及CAG启动子的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pShttle中,构建了重组穿梭质粒pShuttle-CAG-HA。利用Pme I限制性内切酶线性化重组穿梭质粒,然后电转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞,获得重组腺病毒质粒Ad-CMV-HA和Ad-CAG-HA。将两种腺病毒重组质粒Pac I酶切后,按照脂质体转染方法转染AD293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变效应(CPE),筛选到两株重组腺病毒rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA。经RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot试验表明,目的基因已重组到腺病毒的基因组中,并且表达的蛋白具有良好的生物性活性。两株重组腺病毒经过增殖后,其TCID50分别为2.38×108/ml、2.56×108/ml。将获得的重组腺病毒rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA通过肌肉注射的方式免疫6周龄的BALB/c小鼠(6只/组)及SPF鸡(10只/组),初免3周后进行加强免疫。在小鼠试验中,初免2周后,rAd-CMV-HA组和rAd-CAG-HA组均检测到HI抗体,其几何平均数为1:10和1:28;初免3周后,HI效价为1:57和1:80,加免2周后效价迅速上升至1:254和1:254。以A/Chicken/Ahui/2009(H5N1)AIV攻毒,两免疫组体重略有下降即恢复,并无死亡情况,而对照体重下降明显,且分别有两只小鼠死亡。SPF鸡试验中,初免2周后,rAd-CMV-HA组和rAd-CAG-HA组均检测到HI抗体,其几何平均数为1:8和1:10;初免3周后,效价为1:18和1:24,加免2周后效价迅速上升至1:60和1:74。以A/Goose/QFY/2004(H5N1)AIV毒株进行攻毒,显示rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA对SPF鸡的保护率在70%和80%,而对照组SPF鸡在两天内全部死亡。以上结果表明rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA重组腺病毒可以对BALB/c小鼠及SPF鸡对H5N1AIV的攻击提供高效保护。本研究获得了两株能分别利用CMV和CAG启动子控制表达AIV HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,动物试验结果证明它们对BALB/c小鼠及SPF鸡具有良好的免疫保护性,从而为AIV基因工程活载体疫苗的研制奠定了基础。