长双歧杆菌胞外多糖生物合成途经及其对镉胁迫下金鱼的保护作用

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长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是肠道菌群中最普遍存在的一种双歧杆菌。个别双歧杆菌可在生长代谢过程中向细胞外分泌糖类高分子化合物,即胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)。但是,不同菌株所产的EPS生物合成以及结构都有所不同。而且,近年来EPS独特的吸附重金属功能成为了研究热点。因此,本文首先对分离自母乳婴儿肠道的长双歧杆菌A17进行全基因组测序,在遗传水平上研究EPS生物合成。其次,对菌株A17所产EPS进行分离纯化、结构表征以及在镉胁迫下保护鱼体健康等进行探究。主要结论如下:1.全基因组分析结果表明,菌株A17不含质粒,由一条环状的染色体组成,染色体长度为2,501,935 bp,GC含量61.01%。生物信息学分析结果表明,该基因组含合成3种前体糖核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰葡糖和UDP-半乳糖)以及长度约为20 kb的胞外多糖基因簇。另外,碳水化合物代谢能力测定分析结果表明,菌株A17可以代谢D-葡萄糖、半乳糖、D-乳糖、蜜二糖、D-蔗糖、D-棉子糖等6种碳源与生物信息学分析结果一致。2.经过离心、醇沉、透析,从菌株A17的产糖培养基上清中分离到粗品多糖。该多糖通过凝胶层析柱纯化得到单一组分A17-EPS。紫外光谱分析纯度结果表明,A17-EPS为不含蛋白质和核酸杂质。GPC测定A17-EPS分子量为553,817Da。FT-IR谱图中,A17-EPS显示出羟基、烷基、羰基的伸缩振动及弯曲振动等多糖特征吸收峰,表明A17-EPS为多糖类物质,并存在α型糖苷键。甲基化分析与GC-MS、NMR相结合,分析推测出EPS的主要重复单元如下:(?)3.不同镉(Cd2+)浓度对金鱼的死亡效应结果表明,水桶里水中最适Cd2+胁迫浓度是7 mg/L。将不同剂量A17-EPS加入鱼饲料后,对7 mg/L Cd2+胁迫下的各组金鱼测定红细胞核异常、肠道消化酶(淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶)、金鱼肌肉中镉含量。实验结果显示,A17-EPS高剂量组微核率和核异常率,与阳性对照组比较均极显著降低(P<0.01)。在消化酶结果中,A17-EPS低剂量组淀粉酶活性与阳性对照组比有显著差异(P<0.05)。A17-EPS高和中剂量组蛋白酶活性极显著高于阳性对照组(P<0.01),其它处理组间无显著差异。高剂量组肌肉镉含量与阳性对照组相比极显著降低(P<0.01),并呈现随着A17-EPS的剂量提高肌肉镉含量逐渐变低的趋势,表明A17-EPS在镉胁迫下能降低鱼体重金属蓄积、提高肠道消化能力。
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