目的:2018年,在全球范围内所有妇科肿瘤中,卵巢癌发病率为第八位,死亡率位列第七。其标准治疗包括手术联合化疗。然而,化疗耐药已成为卵巢癌预后不良的主要原因。尽管新兴的靶向治疗已经提高了化疗耐药卵巢癌患者的生存率,但由于这些药物的副作用,其生活质量和总体存活率仍然有限,而晚期卵巢癌的5年生存率仅为28.9%。因此,亟需寻找特异性的生物标志物、阐明其耐药的分子机制来提高卵巢癌的治疗疗效。Sirtuins(SIRTs)是一类具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性脱乙酰酶活性并共享高度保守核心结构域的细胞内酶家族。哺乳动物中的SIRTs含有七个成员(SIRT1-7)。大量证据表明,SIRTs能够通过调节能量代谢、DNA损伤修复、基因组稳定性和其他多种与癌症相关的细胞过程,在肿瘤发生中发挥至关重要的作用。目前研究表明SIRTs与卵巢癌关系密切,但仅有少量研究报道了 SIRTs在卵巢癌中的表达情况及其预后价值。此外,即使在同一肿瘤中,SIRTs的具体作用也可能不同,这可能是由于样本量不足造成的。因此,基于生物信息学、充分利用公共大型数据库对SIRTs在卵巢癌中的表达情况、遗传突变模式和预后价值等进行全面分析,将有助于增加科研工作者对SIRTs在卵巢癌中潜在作用的了解。SIRT5是SIRTs家族的特殊成员,其具有多种酶活性,包括NAD+依赖性组蛋白脱乙酰酶、有效的赖氨酸脱丙基酶、赖氨酸脱琥珀酰酶和赖氨酸戊二酸酶活性。这些特定的酶活性表明SIRT5在调节多种细胞代谢过程中起着至关重要的作用,如糖酵解,三羧酸循环,脂肪酸氧化,氮代谢和戊糖磷酸途径。此外,癌症生物学的某些方面,如应激反应,细胞凋亡和自噬,都可以通过SIRT5调节。近年来,细胞代谢的改变被广泛认定为恶性肿瘤的标志,并且大量文献报道SIRT5能够参与肿瘤的发生发展。例如,有研究发现,SIRT5的mRNA或蛋白表达水平与对应的正常组织相比,在非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、结直肠癌、Waldenstrom巨球蛋白血症和乳腺癌中增加。有趣的是,很多研究报道了 SIRT5在癌症中的双刃剑作用。具体来说,在头颈部鳞状细胞癌、肝癌和子宫内膜癌中观察到SIRT5的下调,提示SIRT5的在肿瘤中还可能起到抑癌的作用。此外,SIRT5在肿瘤耐药性方面的作用亦无定论。SIRT5促进NSCLC对顺铂、5-氟尿嘧啶和博来霉素的耐药性。此外,有研究发现Kras野生型结直肠癌中的SIRT5阳性细胞对化疗药物或西妥昔单抗具有抗性。然而,还有研究报道,SIRT5表达与三阴性乳腺癌患者对新辅助化疗的敏感性正相关。此外,通过分析Oncomine数据库发现,化疗应答患者的SIRT5表达水平高于非反应者。综上,SIRT5在肿瘤中的作用尚无定论,需要进一步的研究来探索SIRT5在肿瘤发生和药物抗性中的功能。考虑到SIRT5在癌症生物学中的不同作用,并结合前期生物信息学的分析结果(SIRT5在卵巢癌中高表达并与预后相关),我们推测SIRT5可能是卵巢癌的治疗靶点。迄今为止,SIRT5在卵巢癌中的作用尚未阐明。因此,我们研究了人卵巢癌组织和卵巢癌细胞中SIRT5的表达状态,还揭示了 SIRT5在卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药中的潜在作用。研究方法:1.本研究首先利用一系列数据库(Oncomine、GEPIA、Kaplan-Meier生存分析、TCGA数据库和cBioPortal分析平台)探究了卵巢癌患者中7种SIRT成员的转录表达水平、预后判断价值及遗传变异情况。并利用qRT-PCR及免疫组织化学方法进行验证。利用String数据库绘制SIRTs的蛋白质相互作用网络。利用DAVID分析平台对上述所得互作基因进行了 了基因本体论(GO)富集和KEGG通路分析。2.本研究接下来在卵巢癌组织芯片上进行了 SIRT5免疫组化染色,该芯片包含90例肿瘤组织和10例正常卵巢组织。免疫组化染色是根据ABC免疫染色步骤进行的。由两名独立研究人员通过双盲并随机评估芯片的染色强度和染色细胞百分比后进行评分。染色强度从0到3分,评分标准为:0分为阴性,1分为弱阳性,2中等阳性和3分强阳性。阳性染色细胞的百分比从0到4分,评分标准为:0%为0分,1-25%为1分,26-50%为2分,51-75%为3分,76-100%为4分。最终乘积分数介于0到12之间,如果最终分数≥6,则被认为是SIRT5表达阳性。3.本研究使用了三种人卵巢癌细胞系(A2780、SKOV-3和CAOV-3)。A2780和CAOV-3细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养。SKOV-3细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。上述细胞在37℃、含5%CO2的孵箱中生长。按照厂商的使用说明,利用Lipofectamine 3000试剂对细胞进行瞬时转染。SIRT5表达质粒和相应的空载质粒分别作为SIRT5过表达和阴性对照。用SIRT5-siRNA和阴性对照siRNA转染细胞,进行SIRT5敲低实验。用5mM NAC预处理细胞2小时以抑制ROS的产生。在顺铂存在的情况下,用5μM ML385处理细胞48小时,以阻断Nrf2通路。4.利用CCK-8试剂盒分析评估体外细胞增殖和细胞活力。细胞增殖实验中,以3,000细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中,连续孵育5天。细胞活力检测实验中,以细胞密度为5,000个细胞/孔,接种于96孔板,加入指定浓度的顺铂处理48小时或5天,每2天更换一次含顺铂的培养基。最后,每个孔中加10μl CCK-8试剂,避光孵育2小时。利用酶标仪测定450nm处的吸光度值(OD),并按下列公式进行计算:细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。IC50值的计算采用GraphPad Prism 7.0 软件。5.以500个细胞/孔的密度将实验组或对照组细胞接种在无菌6孔板中。在37℃,5%CO2的孵箱中连续孵育14天后,PBS洗涤3次细胞,Giemsa溶液染色。显微镜下进行计数,≥50个细胞时视为集落。集落形成率=集落数目/500×100%。6.使用探针DCFH-DA检测卵巢癌细胞中顺铂诱导的ROS水平,该探针可以被细胞内的ROS氧化为高度荧光的化合物二氯荧光素。顺铂作用于细胞2、6、24或48小时后,将终浓度为10 μM的DCFH-DA溶液加入细胞悬液,避光孵育20分钟,预冷PBS洗涤3次细胞,从而去除多余荧光探针降低干扰。最后,将细胞重悬于300μl的PBS中,使用流式细胞仪检测荧光强度。采用FlowJo X 10.0.7软件分析数据。根据制造商的说明,利用总谷胱甘肽测定试剂盒测量细胞内GSH水平。收集卵巢癌细胞并在试剂盒中提供的蛋白质去除溶液S中溶解。4℃条件下孵育5分钟后,4℃,10,000 g离心10分钟。25℃条件下,将上清液用测定溶液处理5分钟后,使用酶标仪测量412 nm处的吸光度。绘制标准曲线,并计算相对GSH水平。7.将细胞接种于20 mm培养皿中,指定浓度的顺铂预处理24小时后,观察γ-H2AX焦点形成情况。细胞用PBS洗涤3次后,采用4%多聚甲醛固定15分钟,0.1%Triton X-100处理5分钟进行打孔。室温下,5%牛血清白蛋白封闭1小时,将细胞与γ-H2AX抗体(稀释比例1:200),SIRT5抗体(稀释比例1:200)或Nrf2抗体(稀释比例1:200)在4℃条件下孵育过夜。然后,将TRITC/FITC偶联的二抗(稀释比例1:1000)在室温下与细胞孵育2小时,并用DAPI染核5分钟。使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜采集图像。为了量化γ-H2AX焦点数,通过ImageJ软件对每个载玻片的5个随机区域进行了定量,并且包含≥5个焦点的细胞被认为是阳性细胞。8.总蛋白分离自SIRT5过表达或敲低、经过或未经过顺铂处理的卵巢癌细胞及其相应的对照组细胞。预冷PBS洗涤3次处理后的细胞,并向细胞中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液进行裂解。用10%SDS-PAGE分离等量蛋白质(60μg),并转移至0.45-μm或0.22-μm(后者用于γ-H2AX)的PVDF膜上。在室温条件下,用5%的脱脂牛奶封闭2小时后,将PVDF膜与相应的一抗(抗SIRT5,抗肌动蛋白,抗Nrf2,抗HO-1,抗MnSOD/SOD2,抗BRCA1,抗组蛋白H3或抗γ-H2AX(稀释比例1:1000)在封闭缓冲液中4℃过夜。然后,使用TTBS洗涤3次PVDF膜,并与二抗以1:2500的稀释度在37℃下孵育2小时。使用ECL进行发光检测蛋白表达水平。使用ImageJ软件评估每个条带的灰度值。9.GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一种新开发的基于网页的工具,可提供肿瘤与正常组织的差异表达分析,基于癌症基因组图谱的相关性分析以及基因型组织表达数据。利用该数据库分析SIRT5、Nrf2和HO-1在卵巢癌和正常组织中的表达以及SIRT5与Nrf2、MnSOD和BRCA1之间的相关性。所有实验重复至少三次,数据表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。t检验或单因素方差分析评估组间差异。χ2检验用于评估SIRT5表达与临床病理特征之间的相关性。P<0.05被认为具有统计学显著差异。结果:1.检索Oncomine、GEPIA数据库发现,SIRTs在多种肿瘤中表达异常,在卵巢癌中,SIRT1-3低表达,SIRT5高表达,且在Ⅱ期肿瘤中上调明显,其余SIRTs成员在卵巢癌中的转录表达水平依据不同病理类型及不同数据库而略有差异。采用qRT-PCR及免疫组织化学验证了上述发现。2.利用Kaplan-Meier数据库发现,SIRT1和SIRT4 mRNA水平的降低和SIRT2、3、6和7表达的增加预示了良好的预后。高表达的SIRT5与较短的无进展生存期但与较长的总生存期相关。整体SIRTs家族mRNA表达的上调水平与卵巢癌患者的不良预后相关。依据卵巢肿瘤的复杂病理类型、病理学分级、临床分期及TP53突变与否等因素,并结合不同的观察指标,SIRTs的mRNA异常表达水平显示出较高的预后评估价值。3.利用TCGA数据库和cBioPortal平台探究卵巢癌患者中SIRTs的遗传改变情况。每个SIRT成员的突变率从1.4%到10%不等。其中,SIRT2、SIRT5和SIRT7的突变率较其他成员高,其突变率分别为10%、8%和5%。突变类型较多,以扩增为主,但突变与否与患者预后之间无明显相关性。4.使用String数据库构建了一个由7个SIRT成员和20个与其具备明显相互作用的蛋白质组成的网络。其中,多种细胞代谢相关蛋白如肿瘤蛋白53(TP53)、叉头盒O 1/3/4(FOXO 1/3/4)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、组蛋白转录后修饰相关基因组蛋白脱乙酰基酶1/2/4(HDAC 1/2/4)、E1A结合蛋白p300(EP300)及SUV39H1等与SIRTs密切相关。利用GEPIA数据库计算得出SIRTs成员之间的Pearson 相关系数,范围从 0.073(SIRT1 与 SIRT2)到 0.39(SIRT1 与 SIRT3)不等。还使用DAVID平台对SIRTs及其20个互作蛋白进行了 GO富集和KEGG通路分析。上述互作蛋白基因的主要细胞成分为细胞核和细胞质,主要参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子和DNA模板转录等生物学过程,预测其主要分子功能为与DNA、染色质和转录因子的结合。KEGG通路分析结果显示,在卵巢癌中,上述基因主要参与了如Notch,FOXO等重要的与肿瘤发生发展相关的通路。5.检索GEPIA数据库发现,与正常组织相比,卵巢癌中SIRT5的mRNA水平较高,而其他SIRT成员的mRNA水平较低。利用卵巢癌组织芯片免疫组化染色发现,卵巢癌组织中SIRT5的蛋白表达水平显著高于正常卵巢组织。临床病理相关性分析中,SIRT5蛋白表达水平与FIGO分期(P<0.0001)和淋巴结转移(P=0.0019)呈正相关,而与低分化程度呈负相关(P=0.0179)。在线Kaplan-Meier分析提示SIRT5的高表达与卵巢癌患者不良化疗反应有相关性(P=0.0018)。6.细胞免疫荧光实验发现SIRT5主要定位于细胞浆,少量定位于细胞核。在三种卵巢癌细胞系中,A2780为顺铂敏感型,SKOV-3和CAOV-3为顺铂耐药型细胞,IC50值分别为 9.362±0.489μg/ml、39.743±4.756μg/ml 及 80.813±7.058μg/ml,且 WB 结果显示,SIRT5在耐药细胞中表达高于敏感细胞。顺铂能够以浓度依赖性方式上调SIRT5的表达水平。7.利用CCK-8与集落形成实验发现,与对照组相比,A2780细胞上调SIRT5后能够促进卵巢癌细胞系增殖能力,并提高其顺铂IC50值;SKOV-3和CAOV-3细胞下调SIRT5后能够抑制卵巢癌细胞增殖能力,降低其顺铂IC50值。8.通过WB及细胞免疫荧光实验发现,在顺铂处理的卵巢癌细胞系中,上调SIRT5能够抑制顺铂造成的DNA损伤,即γ-H2AX蛋白水平下降及形成的焦点数下降;下调SIRT5表达后得到相反的结果。9.通过ROS检测试剂盒检测发现,顺铂能够以时间、浓度依赖性方式促进ROS的产生,并且在顺铂作用24小时时ROS水平达到峰值。上调SIRT5能够抑制顺铂诱导的ROS的产生,下调后得到相反结果。使用ROS抑制剂(NAC)并上调SIRT5后,对γ-H2AX的蛋白水平及荧光焦点形成的抑制作用减弱。同时发现,SIRT5能够正向调控DNA损伤修复基因BRCA1的表达,从而降低γ-H2AX的蛋白水平。10.Nrf2通路的关键蛋白Nrf2与SIRT5具有正相关性,且WB验证了上调SIRT5后,Nrf2及其靶基因HO-1的蛋白表达水平上升,下调后得到相反结果。细胞免疫荧光及核浆分离实验证明SIRT5能够促进Nrf2的入核激活。使用Nrf2信号通路抑制剂ML385作用48小时后,Nrf2表达水平明显受抑制,且SIRT5对顺铂诱导的ROS水平的抑制作用明显被减弱。结论:1.SIRT1-4、SIRT6和SIRT7可能是卵巢癌患者潜在的个体化预后评估生物标志物。2.SIRT5可能成为卵巢癌精准治疗的潜在靶点。3.SIRT5在卵巢癌组织中的表达增加,且SIRT5高表达预示化疗反应不良。4.SIRT5促进卵巢癌细胞的细胞增殖和顺铂耐药性。5.SIRT5通过激活Nrf2/HO-1信号通路,从而抑制顺铂产生的ROS依赖性DNA损伤,最终导致卵巢癌耐药的形成。