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国家卫生和计划生育委员会最新数据表明,2013年我国不孕症发病率7%~10%,并有逐年上升的趋势。在不孕症的诸多病因中,广泛排卵障碍性不孕是女性不孕症常见的类型,约占25%~35%[1-3]。卵泡发育成熟障碍可引起不排卵,进而导致不孕,研究卵泡发育成熟障碍的调控机制是目前生殖领域的热点。卵泡发育是一个极其复杂的过程,包括不同时期卵泡形态和功能的变化,受内分泌、局部因子、基因和微小RNA(miRNA)等多因素调控。对卵泡发育调控机制已经取得一些进展,但还有很多问题亟待解决。本研究用miRNA基因芯片筛选在模拟人体卵巢内环境的条件下,不同发育时期的人卵母细胞差异表达的mi RNA,选取特异性高表达miRNA作为研究靶标,用生物信息学方法分析靶标miRNA的靶基因;通过研究靶标miRNA对靶基因表达及功能的影响,探讨靶标miRNA调控卵细胞发育成熟的分子机制,寻找调控卵细胞发育成熟的药物靶点,为防治不孕不育提供提供新的实验依据。第一部分不同发育期人卵母细胞miRNA的差异表达目的:筛选在模拟人体卵巢内环境的条件下,不同发育时期的人卵母细胞差异表达的miRNA,选取特异性高表达miRNA作为研究靶标,分析靶标miRNA的靶基因。方法:收集人GV期、MI期卵母细胞,用含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的培养液培养,以模拟人卵巢内环境,用miRNA微阵列技术筛选不同发育时期的卵母细胞差异性表达的miRNAs;用生物信息学技术预测其靶基因。结果:用含IGF-1的培养液培养,GV期卵母细胞183个miRNA表达上调,117个mi RNA表达下调;MI期卵母细胞145个miRNA表达上调,200个miRNA表达下调。其中,miR-133b在MI期卵母细胞的表达上调32倍,在GV期卵母细胞miR-133b表达无差异。靶基因分析软件显示miR-133b的一个靶基因是TAGLN2;miR-133b的结合位点在TAGLN2 3’UTR第215-250位核苷酸。小结:在模拟人体卵巢内环境的条件下,GV期卵母细胞183个mi RNA表达上调,117个miRNA表达下调,MI期卵母细胞145个miRNA表达上调,200个miRNA表达下调。mi R-133b是MI期卵母细胞特异性高表达的miRNA,其靶基因可能是TAGLN2。第二部分mi R-133b与TAGLN2基因的相互作用目的:分析mi R-133b与转胶蛋白2(TAGLN2)的相互作用,确证TAGLN2是mi R-133b的靶基因。方法:用基因重组技术构建TAGLN2-3’UTR及其突变表达载体(分别命名为psi CHECK-TAGLN2-3’UTR和psi CHECK-TAGLN2-3’UTR-m),用mi R-133b分别与psi CHECK或psi CHECK-TAGLN2-3’UTR或psi CHECK-TAGLN2-3’UTR-m共转染HEK 293T,用双荧光素酶报告基因检测系统分析mi R-133b与TAGLN2结合情况,用免疫印迹和Realtime-PCR分析mi R-133b对TAGLN2表达的影响,免疫荧光分析TAGLN2在MI期卵母细胞的表达及其在亚细胞定位。结果:成功构建psi CHECK-TAGLN2-3’UTR和psi CHECK-TAGLN2-3’UTR-m表达载体,mi R-133b与psi CHECK-TAGLN2-3’UTR共转染HEK 293T细胞后,荧光素酶活性显著降低(p=0.00<0.01),mi R-133b与空载体psi CHECK共转染HEK 293T细胞后,荧光素酶活性没有明显变化(p=0.59>0.05)。mi R-133b与psi CHECK-TAGLN2-3’UTR-m共转染HEK 293T细胞后,荧光素酶活性也没有明显变化(p=0.62>0.05)。mi R-133b与TAGLN2 3’UTR第215-250位核苷酸序列结合。mi R-133b mimics使TAGLN2表达下调;mi R-133b inhibitor可以使TAGLN2表达上调。TAGLN2定位分布人MI期卵母细胞浆,细胞核较少。结论:mi R-133b是MI卵母细胞特异性高表达mi RNA,其靶基因是TAGLN2、结合位点是TAGLN2的3’UTR第215-250位核苷酸序列。mi R-133b下调TAGLN2 m RNA和蛋白的表达。TAGLN2定位于人MI期卵母细胞浆。第三部分mi R-133b靶向TAGLN2调控卵泡的发育成熟目的:探讨mi R-133b靶向TAGLN2调控卵泡发育成熟的机制。方法:首先,选择4周龄和8周龄的雌性ICR小鼠,各6只,采用免疫印记方法检测TAGLN2在4周龄和8周龄小鼠卵巢的表达水平。第二,随机选择4周龄雌性ICR小鼠,分4组,每组6只,采用免疫组化方法检测TAGLN2在窦前卵泡、窦状卵泡、排卵前卵泡及黄体中的定位和表达。第三,随机选择8周龄雌性ICR小鼠,分为3组,每组10只,用免疫荧光染色方法检测GV期、GVBD期及MII期卵母细胞中TAGLN2的表达水平。第四,随机选择8周龄雌性ICR小鼠,分成3组,每组8只,采用TAGLN2 si RNA分析沉默TAGLN2基因前后,卵母细胞直径、透明带厚度变化情况。第五,随机选择8周龄雌性ICR小鼠,随机分成5组,每组8只,通过卵巢多点注射法,将mi R-133b模拟物(mi R-133b minic)、mi R-133b模拟物的阴性对照(mi R-133b minic negative control)、mi R-133b抑制物(mi R-133b inhibitor)、mi R-133b抑制物的阴性对照(mi R-133b inhibitor negative control)及上述制剂的溶剂注射入卵巢,分别统计每只小鼠获卵数,用免疫印迹和实时定量PCR方法检测卵巢TAGLN2的表达。第六,收集GV期卵母细胞,随机分成5组通过显微注射法将mi R-133b minic、mi R-133b minic negative control、mi R-133b inhibitor、mi R-133b inhibitor negative control及上述制剂的溶剂注射至卵母细胞胞浆,观察各组卵母细胞的成熟情况。分析mi R-133b对小鼠卵母细胞成熟的影响。结果:免疫印记显示TAGLN2在4周龄和8周龄小鼠卵巢组织均有表达,8周龄小鼠卵巢TAGLN2的表达水平显著高于4周龄小鼠卵巢(p=0.032<0.05),免疫组化显示TAGLN2在窦前卵泡、窦状卵泡、排卵前卵泡、黄体有表达,且定位于颗粒细胞包膜以及胞浆,细胞核几乎无表达。颗粒细胞TAGLN2的表达水平随着卵泡发育逐渐降低,排卵前卵泡达到最低(p=0.006<0.01p<0.05),至黄体期其表达水平较排卵前卵泡增强。免疫荧光染色显示TAGLN2在小鼠卵母细胞胞浆表达,GVBD期卵母细胞TAGLN2的表达水平显著低于GV期卵母细胞的表达水平(p=0.00<0.01),MⅡ期卵泡卵母细胞中TAGLN2的表达水平最低(p=0.02<0.05)。与对照组相比,TAGLN2-si RNA处理组卵母细胞直径显著增大(p=0.01<0.05),透明带厚度变化无显著差异(p>0.05)。分别给小鼠卵巢及卵母细胞注射mi R-133b minic、mi R-133b minic negative control、mi R-133b inhibitor、mi R-133b inhibitor negative control以注射上述制剂的溶剂作为对照,结果显示:与对照组比较,mi R-133b mimic处理组GV期和MII期卵母细胞数增多,但无统计学意义(p>0.05),mi R-133b inhibitor处理组小鼠GV期和MII期卵母细胞数显著降低(p<0.05);mi R-133b mimic显著诱导卵母细胞的成熟(p<0.05),mi R-133b inhibitor显著抑制卵母细胞的成熟(p<0.05)。mi R-133b mimic下调TAGLN2的表达,mi R-133b inhibitor上调TAGLN2的表达。结论TAGLN2定位于卵泡中颗粒细胞膜和细胞质,其表达与卵母细胞成熟呈负相关。mi R-133b抑制小鼠卵巢TAGLN2 m RNA及蛋白的表达,促进小鼠卵母细胞成熟。