基于量子点/金纳米颗粒的新型光学亲和传感体系的研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a619906915
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近年发展起来的纳米材料如量子点(QDs)、金纳米颗粒(AuNPs)由于表现出各自独特的光电性质,成为新一代最具应用前景的光学标记物,在生物医学和化学/生物传感领域引起了广泛关注。另一方面,生物技术的发展促使生物传感识别元件从酶、抗体、DNA,扩展到了使用适配体、核酶等更便于操纵、性质更为优异的新型亲和分子,进一步拓宽了生物标记和生物探针的应用范围。其中,适配体是经体外指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选出的一类寡核苷酸功能分子,以其高特异性、强亲和力识别靶分子的特点,较之抗体更具备无免疫原性、稳定性强等优点成为新一代亲和识别元件,近年来备受研究者重视。将纳米材料与这些亲和元件结合而构建的纳米生物识别与传感体系,对当代生物分析产生了巨大的推动作用,成为该领域最具活力的研究方向之一。本论文基于功能生物分子-适配体的亲和识别能力以及酶的催化作用,结合使用QDs或AuNPs作为传感换能器的优势,通过将二者有效偶联,得到了一系列亲和型纳米颗粒,并依此构建了多种基于QDs或AuNPs的新型纳米光学亲和传感体系。这些纳米光学传感体系能够实现对于靶分子的简单、灵敏、快速、特异性检测,全文共分为六章。第一章为前言部分,基于功能纳米颗粒在生物标记和传感领域的应用这一前提,阐述了QDs和AuNPs的结构、制备、光学性质,特别是针对与亲和识别元件偶联而形成的功能型纳米光学传感器,对其检测原理、特点和应用进行了评述。同时,对适配体这一新发展的识别元件的定义和特点、及其在生物传感领域的应用做了概述,重点介绍了适配体与纳米颗粒偶联以及用于靶分子,特别是蛋白质检测方面的应用,进而引发出本论文的立题依据和创新点。第二章,作为新的功能型纳米光学传感体系的研究基础,我们改进了传统水相制备QDs的方法,通过高压一锅法,在水相中快速合成了品质良好的碲化镉(CdTe)QDs,并通过X-射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、荧光光谱和吸收光谱对其晶型、形貌和光学性质进行了表征。结果表明,所合成的CdTe QDs具有闪锌矿型(立方体)晶体结构,粒径均匀、分散性好、尺寸分布较窄和发光性能良好的特点。该方法通过使用稳定的Na2TeO3作为Te源,故不需要在氮气保护条件下制备。通过将原料:CdCl2、Na2TeO3、NaBH4和柠檬酸三钠在水溶液中混合并初步成核后,利用高压提供较高的水相反应温度进行合成。较之传统水相合成CdTe QDs原料制备复杂等不足之处,本方法具有操作简单、反应时间短、制备成本和对技术要求低的优点,为开展QDs相关研究提供了一种易于掌握的合成方法。第三章,我们设计合成了一种新型蛋白质-功能分子共价复合物配体。该配体以变性的BSA(dBSA)作为脚手架,于其上共价偶联功能分子后,利用dBSA与QDs表面的亲和作用(氨基、羧基、巯基与CdTe QDs表面未配位Cd原子络合),携带功能分子在QDs表面进行自组装,从而实现功能化;同时,QDs因dBSA的包裹,而使表面得到了有效保护,不易在水相中发生荧光猝灭或团聚。该法克服了使用偶联剂进行功能化修饰时对QDs发光及分散状态的不利影响,使制备得到的dBSA化QDs的荧光强度和稳定性具有较大改善。由此,我们成功制备了表面修饰有单链DNA的CdTe QDs,并对其进行了表征。第四章,我们利用AuNPs对荧光分子的猝灭作用,成功地设计了一种基于适配体识别的增敏型rHuEPO-荧光传感新体系。该体系中,我们于AuNPs表面连接上一段适配体的部分互补序列,而将适配体的5’端标记上羧基荧光素(FAM),适配体通过与其互补序列杂交而拉至AuNPs表面,形成有效的共振能量转移,而致使荧光显著降低;当加入靶蛋白rHuEPO-时,适配体与其特异性结合,将杂交序列中的适配体从AuNPs表面竞争下来,适配体的荧光从而得到恢复。由此,适配体与靶蛋白间的识别转化成为了可测的荧光信号增强过程。该方法简便易行,在实现高选择性识别rHuEPO-的同时,具有较高的灵敏度,达到0.45 nM的水平。第五章,我们利用QDs和AuNPs两种纳米颗粒,共同构建了一种基于适配体识别的rHuEPO-的高灵敏荧光传感检测体系。将rHuEPO-适配体结合于AuNPs表面作为荧光猝灭元件,与ssDNA-CdTe QDs进行杂交,QDs荧光被猝灭。当rHuEPO-加入后,因其特异性结合适配体的特性,杂交链被解开,AuNPs对荧光猝灭效应丧失,从而实现了rHuEPO-的高灵敏度传感,较之第四章所建立的方法,该法结合使用QDs作为能量供体和AuNPs为能量受体的优势,将灵敏度进一步提高至53.6 pM。该法简便易行,也说明了我们在第三章中建立的QDs表面功能化方法的可靠性和有效性,具有很好的应用价值。第六章,我们基于乙酰胆碱酯酶(AChE)对底物硫代乙酰胆碱(ATCh)及抑制剂有机磷毒剂/农药(OPs)的特异性识别,建立了一种基于AuNPs的非标记型高灵敏度检测有机磷毒剂和农药的比色新体系。首先通过配体交换得到表面以硫辛酸(LA)为稳定剂的AuNPs,改善了其稳定性。AChE对ATCh催化产生的硫胆碱(TCh)能够以更高的亲和性与AuNPs表面结合,替换去以相对较弱亲和性结合的LA分子,这一配体交换过程导致原本依靠LA负电荷稳定的AuNPs因表面结合了带正电荷的TCh发生团聚,颜色则由红变蓝。若AChE抑制剂(OPs)存在时,酶催化生成TCh的路线被中断,AuNPs则能保持良好的分散状态而呈现红色。AuNPs的颜色变化与OPs的不同浓度间具备良好的线性关系,实现了在食品基质(如苹果)中对神经性毒剂(VX,GD,GB)的低至pM级的检测,对有机磷农药对氧磷(paraoxon)则达到nM级的检测水平。本法灵敏度高,操作简便,对仪器依赖程度低,是一种极具潜力的现场检测方法。
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