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目的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是严格的嗜上皮病毒。人是其唯一的宿主。HPV不但和女性宫颈良、恶性肿瘤有直接联系,还常导致口腔粘膜、食道、咽喉、气管和结膜等部位的病变。该病毒的高危亚型还往往和鳞状上皮细胞的恶变密切相关。E5一般存在于高危型HPV,在导致良性肿瘤的低危型HPV中经常缺省,这一特点可能和高危型HPV的致癌作用具有潜在联系。目前有关HPV的研究大都围绕HPV的癌基因E6、E7展开,而鲜有针对E5基因的研究报道。本实验构建了E5真核表达载体成功转染人口腔上皮细胞,并对上皮细胞相关生物学特性进行了初步分析,研究结果将为深入研究E5基因功能奠定基础。方法①E5基因的PCR扩增与克隆：通过比较高危型HPV全序列,在E5的上下游保守区设计一对引物(分别含有BamHI，HindⅢ阝艰制性酶切位点),PCR反应,回收纯化产物,获得带有酶切位点的E5基因片段,序列分析；将HPV16 E5连接到质粒pGEM-T,构建质粒pGEM-T-E5,双酶切,测序鉴定。②真核表达载体的构建：设计带有一对酶切位点(HindⅢ, BamHⅠ)的HPV E5引物,分别回收,纯化双酶切下的HPV16 E5 DNA以及真核表达载体pLEGFP-N1l片段,连接回收产物构建成真核表达载体pLEGFP-E5,利用PCR扩增、酶切和测序方法进行鉴定。③利用PA317包装细胞体系包装成逆转录病毒,并感染NIH3T3细胞,确定病毒滴度。④人口腔上皮细胞的原代培养并利用细胞爬片免疫组化法进行鉴定,确定其上皮来源后,利用构建逆转录病毒将HPV16 E5基因转染入人口腔上皮细胞内,并利用PCR、RT-PCR等多种检测方法进行检测确认是否表达。⑤利用MTT法、细胞黏附及伸展试验,研究HPV16 E5基因对人口腔上皮细胞生物学性状的影响。结果①构建含HPV16 E5基因的真核表达载体pLEGFP-E5。酶切和测序鉴定表明,E5被正确插入到载体质粒的多克隆位点内。②将pLEGFP-E5转染PA317包装细胞,获得的逆转录病毒可以转染真核生物细胞。③将HPV16型E5基因转染入人口腔上皮细胞内,经PCR和RT-PCR验证E5基因可以表达,转染后细胞的生物学行为试验表明：HPV16 E5基因可促进人口腔上皮细胞黏附及增殖(P<0.05),而对细胞伸展无明显影响(P>0.05)结论HPV16 E5基因可以提高人口腔上皮细胞细胞活性,促进细胞黏附及增殖,延长其生命周期。