本文对基于TFAP2E甲基化水平构建的智能型双药协同纳米投递系统在胃癌治疗中的应用进行了探讨。本研究分为两个部分：　　第一部分：TFAP2E甲基化介导的胃癌细胞株对5-FU耐药的研究研究。　　背景：基因异常甲基化不仅参与了恶性肿瘤的发生发展，而且与化疗药物的敏感性也密切相关。目前，虽然新的化疗药物不断发展，但仍然有众多胃癌患者因为对化疗药物不敏感而导致肿瘤复发或转移，以至于患者生存期缩短，生活质量不高。因此，从表观遗传学角度出发，寻求新的胃癌治疗分子靶点，联合使用去甲基化药物与化疗药物，可能是胃癌患者治疗选择的新方向。已有研究表明在结直肠癌患者中，转录因子AP-2ε(TFAP2E)基因启动子区呈现的高甲基化状态可导致5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药，体外采用5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine，DAC）对肠癌细胞进行去甲基化处理，使TFAP2E重新表达后，可下调5-FU耐药相关基因dickkopf homolog4(DKK4)的表达，从而显著提高5-FU的抗肿瘤效果、逆转耐药。　　目的：检测MKN45、MKN28、SGC7901、BGC823四种人胃癌细胞株TFAP2E甲基化状态，筛选出高甲基化和低甲基化TFAP2E的人胃癌细胞株，研究DAC同时联合5-FU，DAC序贯联合5-FU对人胃癌细胞株增殖能力及凋亡的影响。进一步探讨人胃癌细胞株在DAC作用前后TFAP2E和DKK4 mRNA表达水平的变化情况。　　方法：通过荧光定量甲基化特异性PCR(real-time Methylation-Specific PCR，Methylight)检测四种人胃癌细胞株的TFAP2E甲基化情况，筛选出高甲基化和低甲基化TFAP2E的肿瘤细胞。MTT法检测5-FU单药，DAC单药，DAC同时联合5-FU，DAC序贯联合5-FU对肿瘤细胞增殖活性的影响。流式细胞仪检测细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chainreaction，Q-PCR)检测DAC处理前后肿瘤细胞TFAP2E和DKK4 mRNA的表达水平变化情况。　　结果：在这四种人胃癌细胞株中，MKN45细胞株为TFAP2E高甲基化(甲基化率98.7％)，MKN28细胞株为TFAP2E低甲基化（甲基化率0.7％）。体外细胞毒性实验发现，10μmol/L的DAC对肿瘤细胞仅有低度毒性，只有在每隔24小时，以含有相同浓度DAC的细胞培养液对细胞进行三次换液(DAC×3，72h)，序贯应用5-FU的情况下，MKN45的细胞增长率才明显低于其他含有5-FU的实验组(P＜0.05)。凋亡实验的结果同MTT结果一致，DAC×3，72h序贯5-FU后凋亡率为（55.33±4.12％），其他组的凋亡率分别为5-FU（24.43±3.22％），DAC+5-FU(25.43±1.22％)，DAC72h+5-FU(28.43±1.22％)。而作为TFAP2E低甲基化的阴性对照MKN28细胞，无论是DAC和5-FU的同时应用还是序贯应用，其对肿瘤细胞的抑制作用同单用5-FU区别不明显(P＞0.05)。进一步对其机制进行研究，DAC仅一次使用，对MKN45细胞TFAP2E调控作用不明显，而DAC×3，72h明显上调了MKN45细胞TFAP2E mRNA的表达水平，同时相应地下调了DKK4 mRNA的表达水平。但对于MKN28细胞，无论是DAC单次应用还是DAC×3，72h，作用前后TFAP2E和DKK4的基因表达水平变化不明显(P＞0.05)。　　结论：一定浓度的DAC对肿瘤细胞持续作用一定的时间(DAC×3，72h)，才能起到甲基化抑制作用，从而调控因启动子高甲基化而被沉默的基因表达。DAC对MKN45细胞持续作用一段时间后，可增强5-FU对该肿瘤细胞的抑制作用，其可能的机制是:DAC对TFAP2E的去甲基化作用，上调了TFAP2E的表达水平，相应地下调了5-FU耐药基因DKK4的表达，逆转耐药。为研究TFAP2E甲基化状态和化疗药物敏感性的分子机制提供了实验依据。　　第二部分：基于TFAP2E甲基化水平构建5-FU/DAC明胶酶靶向纳米粒子及其抗肿瘤作用评价。　　背景：已经有研究表明TFAP2E基因启动子区域的高甲基化状态可导致5-FU耐药，体外采用DAC对肿瘤细胞进行去甲基化处理使TFAP2E重新表达后，可以显著提高5-FU的抗肿瘤效果、逆转耐药。第一部分人胃癌细胞株的体外实验也同样证实了这一结论。但是，DAC作为一种泛甲基化抑制剂，对全基因组都具有很强的去甲基化作用，作用于正常组织会产生严重的毒副反应;其次，DAC本身的不稳定性、生物利用度差等缺点也限制了其在体内的应用。从第一部分的实验可以看到，DAC的单次应用对基因的调控作用不明显，只有一定浓度的DAC对肿瘤细胞连续作用一定的时间(DAC×3，72h)，才能有效地抑制基因甲基化、上调基因的表达。同时，5-FU作为一种传统的化疗药物，对正常组织也有明显的毒副作用，如消化道反应和骨髓抑制等。高分子纳米载体的出现很好地解决这些问题:高分子纳米载体负载理化性质不稳定的药物后，其对药物的控释模式很大程度上避免了理化性质不稳定的药物在短时间内完全分解，延长了药物作用时间。除此之外，纳米粒子作为药物载体，根据其自身性质及肿瘤组织的生物学特性可特定地到达肿瘤部位，对非靶向部位伤害明显降低，在提高药物疗效同时，又能避免药物全身作用带来的毒副反应。因此，针对药物的作用机理，有目的地设计和制备高分子纳米载药体系，有望提高药效，并降低药物的毒副作用。　　目的：提高胃癌化疗疗效，逆转耐药以及降低化疗毒副作用是临床迫切需要解决的问题。本论文是在实验室前期成功构建明胶酶(MMP2/9)靶向纳米载体的基础上，以最新研究发现甲基化抑制剂DAC可改变TFAP2E基因高甲基化状态，抑制5-FU耐药基因表达，从而增强其抗肿瘤效果为依据，构建具有明胶酶靶向的DAC/5-FU双药纳米粒子。全面考察其理化性质，体外研究该纳米载药体系对TFAP2E表达水平的影响及对肿瘤的抑制作用和可能的分子机制，明确其作为一种新型的协同靶向药物控释体系在胃癌治疗中的价值。　　方法：通过两次酰胺法和开环聚合法合成具有明胶酶底物肽段的高分子纳米靶向载体mPEG-Peptide-PCL。采用双乳液-溶剂挥发法制备负载DAC酶靶向纳米粒子，5-FU酶靶向纳米粒子和DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子。利用透射电子显微镜观察该纳米粒子的形态学特征，并采用动态光散射仪(Dynamic lightscattering，DLS)来测定纳米粒子的粒径大小和Zeta电位。利用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）来测定纳米粒子的载药量和包封率，并且测定体外96小时药物5-FU释放情况和DAC的化学分解情况。选取第一部分实验筛选出MKN45和MKN28细胞为研究对象，采用明胶酶谱法和免疫组化方法检测肿瘤细胞的明胶酶表达水平。通过荧光摄取实验观察肿瘤细胞对负载荧光剂罗丹明-B纳米粒子的摄取情况。通过MTT法检测药物对肿瘤细胞增殖抑制情况，流式细胞仪检测细胞凋亡，全面考察酶靶向纳米粒子对肿瘤细胞的细胞毒作用。并采用Q-PCR检测DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子作用前后胃癌细胞TFAP2E和DDK4的表达变化情况。　　结果：合成了mPEG-Peptide-PCL高分子靶向药物载体，并采用核磁方法验证其结构。合成了负载DAC，5-FU单药酶靶向纳米粒子和DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子，通过动态光散射仪、HPLC和电镜等检测方法验证了其结构及稳定性。通过明胶酶谱法和免疫组化方法检测到MKN45和MKN28人胃癌细胞株的明胶酶表达水平相似。荧光摄取实验表明这两种肿瘤细胞对酶靶向纳米粒子的摄取效率接近。细胞毒性实验表明DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子可提高5-FU对MKN45细胞抑制作用，但是对于MKN28细胞，这种药物协同效应未得到证实。进一步对其机理进行研究，发现DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子可上调MKN45细胞的TFAP2E表达水平，与之相应的是降低DKK4的表达水平。而对于TFAP2E低甲基化的MKN28细胞，在DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子的作用前后，TFAP2E和DKK4的表达水平未出现明显的差异。　　结论：⑴一定浓度的DAC持续作用于TFAP2E高甲基化的MKN45人胃癌细胞株，可上调TFAP2E的表达水平，相应地下调DKK4表达水平，从而提高了5-FU对MKN45的药物敏感性。⑵研究中所制得DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子呈现较为规则的球形，粒径大小理想、形状稳定，具有缓释、靶向的特征，可以提高DAC在水溶性状态下的稳定性，增强其去甲基化药物效应。⑶体外细胞的实验证明，在对TFAP2E高甲基化的MKN45胃癌细胞抗肿瘤效果方面，DAC/5-FU双药酶靶向纳米粒子优于5-FU的单药酶靶向纳米粒子及DAC+5-FU双裸药。其可能的机制是酶靶向纳米粒子对DAC的控释模式，增强了其去甲基化效应，上调了TFAP2E的表达水平，并相应地下调了5-FU的耐药基因DKK4的表达水平。