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由于植物细胞在进行光合作用的过程中.同时发生着光呼吸,导致净光合速率会下降25%-50%。乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)作为光呼吸途径的关键酶之一,定位于过氧化物酶体中,以黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)为辅因子催化乙醇酸氧化为乙醛酸。在人体内,GOX可以催化乙醇酸和乙醛酸生成草酸,而草酸是肾结石的主要成分,因此近年来GOX被作为一个治疗肾结石和原发性高草酸尿综合征的有效靶点。目前,人们已在酶学等方面对GOX有了一定了解,并解析了一些含FMN的GOX晶体结构,但是,尚无不含辅因子FMN的GOX结构的报道,人们对于GOX如何行使其催化功能的分子机制、FMN如何结合到活性中心的过程等并不清楚。为了解决上述问题,本论文结合结构生物学以及生物化学与分子生物学等方法对此进行了深入研究。本论文通过原核表达并在纯化过程中尝试多种缓冲液后,获得了含有辅因子FMN的本生烟GOX蛋白(Holo-GOX)和不含辅因子FMN的本生烟GOX蛋白(Apo-GOX),采用蒸汽扩散法成功获得并优化了 Holo-GOX和Apo-GOX的蛋白晶体,进而解析了它们的晶体结构。通过中性缓冲液纯化的GOX含有FMN,具有很强的酶活力;而通过弱碱性缓冲液纯化的GOX不含FMN,基本丧失了酶活力。本论文首次获得了 Apo-GOX的晶体结构,通过分析比较Holo-GOX和Apo-GOX的结构发现,它们都是由8个排列在内侧的β折叠片层和8股环绕在外侧的α螺旋组成的(β/α)8桶型结构。在Holo-GOX中.FMN位于桶型结构β折叠组的羧基端,通过氢键与GOX相结合,loop6、loop4和αB-αC之间的loop形成“盖子”盖在桶型结构β折叠组羧基端的开口处,阻止FMN解离。在Apo-GOX中,loop6和αB-αC之间的loop向外侧溶液方向摆动,将开口打开,同时loop4上的αD消失,整体柔性也变得更大,“盖子”变为开启状态,FMN从GOX上解离,活性中心口袋的电荷也随着结构发生了变化。Holo-GOX和Apo-GOX在晶体结构和溶液中都以四聚体形式存在,但Apo-GOX的聚集状态更为松散。在对Apo-GOX各亚基互作界面的分子间作用力进行分析后发现,一些在Holo-GOX亚基之间形成的盐键和氢键网络,特别是组成“盖子”的3个loop中的氨基酸残基部分,在Apo-GOX中随着结构的变化而消失。本论文首次发现一个存在于分子间界面的pH传感器(sensor),当缓冲液从中性变为弱碱性时,pH传感器内的分子间作用力减弱甚至被破坏,导致盖子结构由“关闭”变为“打开”状态,从而释放FMN。在这个过程中,四聚体中的每个亚基轻微旋转,桶型结构β折叠组羧基端开口处的互作面积减少,同时GOX羧基末端“尾巴”处的αG与相邻GOX的α6形成新的结合表面。在与同源性较差的人GOX的结构进行比对后发现,该分子间pH传感器同样存在。本论文通过解析Holo-GOX和Apo-GOX的晶体结构,为深入研究GOX的催化作用机制提供了结构依据,为通过调节pH来改变GOX的酶活性从而控制光呼吸途径提供了新思路,为以GOX为靶点的肾结石和原发性高草酸尿综合征的治疗提供了新的方向。