研究目的股骨头坏死包括骨细胞、骨髓组织和脂肪细胞的坏死,晚期股骨头会发生塌陷、变形,髋关节间隙变窄甚至消失,临床表现主要为髋关节疼痛和活动范围受限。目前该病早期缺乏有效的治疗方法,晚期只有全髋关节置换术(THA)才可以有效改善髋关节功能。在非创伤性股骨头坏死中,激素性股骨头坏死的发病率最高,其发病年龄低、病情进展快的特点决定了很多患者在比较年轻的时候接受了THA。由于假体寿命的限制,年轻时接受该手术难免要行1次甚至多次翻修术,不仅要承受多次手术的痛苦和经济压力,翻修术的效果也明显不如初次置换,因此,在激素性股骨头坏死的早期控制病情发展具有十分重要的意义。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是组织工程常用的种子细胞,在股骨头坏死的治疗中有着广阔的应用前景,就BMSCs的来源、分离与培养方法、移植途径等方面还需进一步研究。血管内皮生长因子(VEGF)在骨与血管生成的调控中居于中心地位,在其5种异构体中VEGF-α是发挥作用的主要成分,其表达水平可有效反映骨组织的生理状态。目前对骨组织中该因子表达的研究多停留在定性阶段,我们采用荧光定量PCR (RT-PCR)技术定量比较不同组之间VEGF-α的表达水平,可以更精确的分析BMSCs移植后骨组织生理状态的变化。本研究采用激素法建立股骨头坏死动物模型,从自体胫骨骨髓中分离BMSCs体外培养并移植,在组织病理学观察的基础上采用RT-PCR技术定量检测VEGF-α的表达来评估治疗效果,以探索早期股骨头坏死的治疗方法。材料与方法实验一1.约3月龄的新西兰大白兔20只,随机分为模型组与对照组,每组10只,模型组肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠20mg/kg,共1次,对照组同时肌肉注射等量生理盐水。所有动物肌肉注射青霉素钠4×105IU,每周2次。2.给药6周后,空气栓塞法处死所有动物,严格无菌操作取下双侧股骨头,一侧置于10%福尔马林溶液中固定,另一侧冻存于-80℃低温冰箱中,分别用于组织病理观察和RT-PCR检测。实验二1.约3月龄新西兰大白兔30只,随机分为A(动物模型组)、B(生理盐水组)、C (BMSCs治疗组)3组,每组各10只。所有动物采用与实验一相同的方法建立动物模型,用药后肌肉注射青霉素钠4×105IU,每周2次。2.给药4周后C组动物在静脉麻醉下抽取双侧自体胫骨骨髓约10ml,简单离心法分离BMSCs并体外培养,传代1次后制成细胞悬液。3.C组动物静脉麻醉后用手摇钻在左侧大转子下钻孔,将细胞悬液注入骨髓腔,B组动物采用相同方法注入等量生理盐水,术后所有动物肌肉注射青霉素钠4×105IU,每天1次,5天后改为每周2次。4.移植术后4周空气栓塞法处死所有动物,严格无菌操作取出左侧股骨头,沿冠状面剖开,一半置于10%福尔马林溶液中固定用于组织病理观察,另一半冻存于-80℃低温冰箱中留作RT-PCR检测,观察VEGF-α表达的变化。结果实验-组织病理切片(HE染色)：模型组9例标本进入结果分析,病理观察可见软骨下区骨组织内出现大量空骨陷窝,脂肪细胞体积与排列紊乱,细胞边界不清,骨髓组织中细胞数量减少、细胞核固缩,可见均质红染的坏死区,部分标本可见骨小梁断裂,模型组9例标本中有7例诊断为骨坏死,对照组没有标本符合骨坏死诊断标准。]RT-PCR检测：模型组VEGF-α的表达较对照组明显降低。实验二组织病理切片(HE染色)：C组标本中空骨陷窝的分布明显少于另外两组,脂肪细胞的体积与排列较A、B两组规则,骨髓组织中细胞非常密集；而A、B两组脂肪细胞体积与排列紊乱,细胞边界不清,骨髓组织中细胞数量较少,可见均质红染的坏死区。C组中有2例诊断为骨坏死,而A、B组中各有7例符合骨坏死诊断标准。RT-PCR检测：C组VEGF-α的表达最高,与A、B组相比均有统计学差别,A组和B组之间的差别没有统计学意义。结论1.短期大剂量糖皮质激素冲击可显著抑制血管内皮生长因子-α (VEGF-α)的表达。2.兔自体胫骨骨髓是骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可靠来源,简单离心法分离纯化后体外培养可满足治疗的需要。3.自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可显著上调血管内皮生长因子-α(VEGF-α)(?)表达,是治疗兔早期激素性股骨头坏死的有效方法。4.1次肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠20mg/kg可成功建立兔激素性股骨头坏死的动物模型。