支链氨基酸(Branched chain amino acids,BCAAs)尤其是亮氨酸补充对胰岛素抵抗和2型糖尿病的干预作用目前尚无一致性结论,并且其中的机制仍不清楚。有研究者认为,亮氨酸在机体处于合成代谢或分解代谢的状态下,具有不同的甚至是相反的干预作用。2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)等代谢性疾病的发生发展是一个漫长的过程,不同阶段机体的代谢状态不同。现有研究报道的BCAAs对T2DM的干预只是在某一个时间点的结果,不足以全面反映BCAAs补充对T2DM整个发展过程的影响。线粒体是机体物质代谢和能量代谢的“工厂”,同时也是BCAAs代谢的重要场所。在高脂背景下,亮氨酸补充可能会加重线粒体负荷,但同时研究发现,亮氨酸可促进中老年动物机体线粒体的生成,增强机体抗氧化能力,改善线粒体功能。因此,在胰岛素抵抗和T2DM发展的不同阶段,亮氨酸干预对机体代谢的影响及线粒体调控机制值得进一步深入研究。本研究对高脂膳食喂养诱导的胰岛素抵抗大鼠进行亮氨酸干预,以限食干预作为对照。在高胰岛素血症和高血糖阶段,采用基于超高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)的代谢组学研究方法,寻找不同时间点的差异代谢物,阐明亮氨酸干预引起的整体代谢水平的改变;同时观察亮氨酸补充对大鼠在胰岛素抵抗不同阶段BCAAs代谢,以及骨骼肌线粒体结构、线粒体生成和线粒体功能的影响,为阐明BCAAs在胰岛素抵抗和T2DM中的作用以及相关机制提供科学依据。本研究分为以下两部分:第一部分亮氨酸干预大鼠不同阶段胰岛素抵抗的代谢组学研究目的:通过分析亮氨酸补充对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠不同时期血清代谢轮廓的影响,寻找不同时间点的差异代谢物,为解释亮氨酸补充对胰岛素抵抗的不同干预效果和相关的代谢机制提供线索。方法:雄性6周龄SD大鼠96只随机分为对照组(Normal Diet,ND)、高脂组(High Fat Diet,HFD)、限能组(HFD with calorie restriction,HFD+CR)和亮氨酸干预组(HFD supplemented with leucine,HFD+Leu)。分别喂饲普通饲料,高脂饲料,高脂组进食量的80%,高脂饲料添加1.5%亮氨酸。24周和32周末分别进行葡萄糖耐量(Glucose Tolerance Test,GTT)和胰岛素耐量实验(Insulin Tolerance Test,ITT),计算曲线下面积(Area under curve,AUC),ELISA法测定血清胰岛素水平,比色法检测血清葡萄糖水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),评价大鼠胰岛素敏感性。实验结束后,动物禁食,处死后收集各组大鼠血清。比色法检测血清甘油三酯(Triglycerides,TG)和总胆固醇(Total Cholesterol,TC)水平,HPLC-MS/MS对两个时点血清氨基酸水平和其他代谢物进行分析,运用正交偏最小二乘法-判别分析识别显著差异的变量,进一步通过变量重要性投影值和两独立样本的t检验筛选差异性代谢物,Metaboanalyst对筛选的代谢物进行代谢通路分析。结果:1.体重和进食量:HFD组大鼠从第3周开始能量摄入量显著高于ND组;除了第5周HFD+Leu组大鼠能量摄入量显著低于HFD组外,其他时点两组均无显著差异;HFD组大鼠体重从第5周开始显著高于ND组;HFD+Leu组大鼠体重从13周开始显著低于HFD组;HFD+CR组大鼠从第3周开始体重显著低于HFD组。2.胰岛素敏感性:高脂膳食喂养24周,与ND组大鼠相比,HFD组大鼠血糖水平未见明显改变,但血胰岛素水平显著升高;亮氨酸干预24周对HFD组大鼠血糖、血胰岛素和HOMA-IR均无显著影响;而限能可显著降低高脂组血胰岛素水平。高脂膳食喂养32周,与ND组大鼠相比,HFD组血糖、血胰岛素和HOMA-IR均显著升高;亮氨酸干预32周,与HFD组相比血糖未见明显改变,血胰岛素水平有降低的趋势,HOMA-IR显著降低;HFD+CR组大鼠血糖、血胰岛素和HOMA-IR与HFD组相比均显著降低。ITT和GTT实验结果表明,高脂喂养24周,HFD组ITT和GTT曲线下面积均显著高于ND组;HFD+Leu组及HFD+CR组大鼠ITT和GTT曲线下面积均显著低于HFD组;高脂喂养32周,HFD组大鼠ITT和GTT曲线下面积均显著高于ND组;HFD+Leu组GTT曲线下面积显著低于HFD组;HFD+CR组大鼠ITT和GTT曲线下面积均显著低于HFD组。结果表明,24周时高脂组大鼠整体出现胰岛素抵抗,但血糖水平正常,而在32周时高脂组大鼠出现高血糖高胰岛素状态,提示胰岛素的敏感性进一步降低,胰岛素控制血糖的能力进一步减弱。亮氨酸干预在这两个阶段表现为不同程度地改善整体胰岛素抵抗的作用。3.血清氨基酸水平:与HFD组相比,24周,HFD+Leu组血清支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸)以及生糖氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)水平均显著升高,生酮氨基酸赖氨酸水平显著降低;HFD+CR组血清异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸均显著降低,而半胱氨酸显著升高。与HFD组相比,32周,HFD+Leu组血清生糖氨基酸脯氨酸水平显著升高,而天冬氨酸和甘氨酸水平显著降低;HFD+CR组生糖氨基酸丙氨酸和脯氨酸水平显著升高。4.血清HPLC-MS/MS代谢组学结果分析:通过正交偏最小二乘法-判别分析,24周和32周,HFD+Leu组、HFD+CR组与对应HFD组样本均可显著区分。差异代谢物及通路分析结果表明,亮氨酸干预主要参与氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、胆汁酸代谢等。但不同时间点,与对应HFD组相比,HFD+Leu组的代谢物变化趋势不同。24周,HFD+Leu组血清氨基酸代谢产物(L-犬尿氨酸,5-羟色胺,亚精胺,2-羟基异丁酸,肌酸,肌苷酸等)、脂肪酸代谢产物(3-羟基丁酸、棕榈酸、乙酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉碱、溶血磷脂酰胆碱等)、三羧酸循环中间产物(反式丁烯二酸、顺式丁烯二酸、苹果酸、α-酮戊二酸等)、胆汁酸代谢产物(熊去氧胆酸)和嘌呤代谢产物(尿囊素、尿酸)均显著增加。32周,HFD+Leu组血清脂肪酸代谢产物有下降的趋势,其中棕榈酸、棕榈酰肉碱显著降低;三羧酸循环中间代谢产物也呈下降趋势,其中柠檬酸、苹果酸、富马酸显著降低;氨基酸分解代谢产物减少,其中5-羟色胺、S-(腺苷基)-L-高半胱氨酸和肌酸显著增加、溶血磷脂酰胆碱(C18:1,C16:0,C20:4)和胆汁酸代谢产物(熊去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨胆酸)显著增加。24周,HFD+CR组与HFD组相比,血清氨基酸代谢产物(亚精胺,4,6-二羟基喹啉,肌苷酸),脂肪酸代谢产物(棕榈酸,肉碱),溶血磷脂酰胆碱(C18:1,C16:0,C16:1),胆汁酸代谢产物(甘氨鹅脱氧胆酸,甘氨酸)显著增加;32周,HFD+CR组与HFD组相比,血清氨基酸代谢产物(亚精胺,4,6-二羟基喹啉,S-(腺苷基)-L-高半胱氨酸),棕榈酸,溶血磷脂酰胆碱(C18:1,C16:0,C16:1),胆汁酸代谢产物(熊去氧胆酸,甘氨鹅脱氧胆酸,甘氨酸)显著增加。结论:尽管亮氨酸干预改善高血胰岛素和高血糖阶段机体总的胰岛素敏感性,但两个阶段血清代谢物的变化趋势不同,主要表现在三羧酸循环、脂肪酸代谢和氨基酸代谢等。在24周高血胰岛素阶段,血清氨基酸及其分解代谢产物,脂肪酸分解代谢产物及三羧酸循环中间产物增加;而在32周高血糖阶段,血清氨基酸及其分解代谢产物、脂肪酸分解代谢产物和三羧酸循环中间产物降低。限能干预组与亮氨酸干预组血清代谢物改变不同。结果提示,亮氨酸干预在胰岛素抵抗不同阶段发挥作用的机制不同,24周时分解代谢增强,而在32周可能主要表现为促进合成代谢。第二部分亮氨酸干预大鼠不同阶段胰岛素抵抗的线粒体调控机制研究目的:通过高脂膳食喂养建立胰岛素抵抗大鼠模型,并同时进行亮氨酸干预。观察亮氨酸干预对大鼠胰岛素抵抗不同阶段机体BCAAs代谢,以及骨骼肌线粒体超微结构、线粒体生成(线粒体DNA含量和线粒体生成相关基因的表达)和线粒体功能(氧化磷酸化功能蛋白的表达和血清ATP含量)等相关指标的的影响,进一步揭示亮氨酸调节胰岛素抵抗的分子机制。方法:动物饲养及分组同第一部分。每组分别喂养24周或32周,实验结束后处死动物并留取不同时间点血清和各组织样本。比色法检测各时间点血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。HPLC-MS/MS检测不同时间点大鼠空腹状态血清中BCAAs分解代谢相关产物一3种支链α-酮酸(Branched-chain keto acids,BCKAs)和 Propionyl(C3)、Isovaleryl/2-methylbutyryl(C5)乙酰肉碱水平以及 ATP 含量。Westernblot 检测肝脏、骨骼肌和脂肪组织中BCAAs代谢关键酶:线粒体支链氨基酸转移酶(Mitochondrial branched-chain amino transferase,mBCAT)、支链 α-酮酸脱氢酶复合物 Elα 亚基(Branched-chain alpha keto acid dehydrogenase E1 α,BCKDElα)和支链 α-酮酸脱氢酶激酶(Branched-chain α-ketoacid dehydrogenase kinase,BCKDK)的蛋白表达水平。透射电镜观察不同时间点骨骼肌线粒体超微结构。实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测不同时间点骨骼肌线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)和线粒体生成相关基因核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1,NRF-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(Peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-lα,PGC-1α)、去乙酰化蛋白 1(Sirtuin1,SIRT1)、线粒体转录因子 A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)的mRNA表达水平。Western blot检测骨骼肌线粒体氧化磷酸化蛋白复合物(Oxidative phosphorylation complexes,OXPHOS),蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)以及磷酸化AKT在不同时间点的表达水平。结果:1.骨骼肌胰岛素敏感性:高脂喂养导致骨骼肌胰岛素刺激状态下pSer473AKT蛋白表达水平显著降低。24周时,HFD+Leu组与HFD组相比,基础状态和胰岛素刺激状态下,骨骼肌pSer473AKT蛋白表达水平均无明显改变;32周HFD+Leu组与HFD组相比,胰岛素刺激状态下,骨骼肌pSer473AKT蛋白表达水平显著增加。HFD+CR组两个时间点胰岛素刺激状态下,骨骼肌pSer473AKT蛋白表达水平均显著增加。2.BCAAs代谢产物:喂养24周,HFD组血清BCKAs水平与ND组未见明显差异;与HFD组相比,HFD+Leu组亮氨酸脱氨基产物α-酮异已酸(Keto-isocaproate,KIC)水平显著升高;而HFD+CR组缬氨酸脱氨基产物α-酮异戊酸(keto-isovalerate,KIV)水平显著降低。喂养32周,HFD组血清KIC和KIV水平均显著高于ND组;与HFD组相比,HFD+Leu组异亮氨酸脱氨基产物3-甲基-2-氧代戊酸(α-Keto-β-methylvalerate,KMV)水平显著增加;而HFD+CR组KIC水平显著降低。2个时间点各组大鼠血清C3和C5肉碱水平均无显著差异。3.BCAA分解代谢相关酶的蛋白表达水平:喂养24周,HFD组骨骼肌和脂肪组织BCATm表达水平较ND组显著增加,BCKD发挥活性的主要调节亚基E1αα以及调节BCKD活性的激酶(BCKD kinase,BCKDK)的蛋白表达水平无明显改变。与HFD组相比,HFD+Leu组骨骼肌组织和脂肪组织BCATm、BCKDK的蛋白表达水平显著增加,肝脏组织BCKDK的蛋白表达水平显著增加。HFD+CR组与HFD组相比,除了骨骼肌组织BCKDK的蛋白表达水平均显著增加外,其他组织代谢酶的蛋白表达基本无明显改变。喂养32周,与ND组相比,HFD组骨骼肌组织BCATm、BCKDK的蛋白表达水平均显著增加,而BCKDHE 1α的蛋白表达水平显著降低;脂肪组织BCATm表达水平显著降低。与HFD组相比,HFD+Leu组除了脂肪组织BCATm表达水平的增加外,其他BCAAs代谢酶的表达基本无明显改变。HFD+CR组与HFD组相比,骨骼肌组织BCATm、BCKDK蛋白表达水平显著降低,而BCKDHE1α表达水平显著升高;脂肪组织BCATm蛋白表达水平显著升高,肝脏组织代谢酶的表达基本无明显改变。4.血清氧化应激水平:长期高脂膳食导致血清MDA水平显著升高,而SOD活力显著降低。24周,与HFD组相比,亮氨酸干预组血清MDA水平无明显差异,但SOD活力显著降低;HFD+CR组血清MDA水平和SOD活力均无统计学差异。32周,与HFD组相比,HFD+Leu和HFD+CR组血清MDA水平显著降低,而SOD活力显著增加。5.骨骼肌线粒体生成及线粒体功能相关指标:喂养24周,骨骼肌超微病理结果显示,亮氨酸干预加重高脂喂养导致的线粒体损伤,线粒体肿胀明显,部分线粒体出现严重空泡化,线粒体嵴大部分消失;骨骼肌线粒体生成基因TFAM,PGC-1α和SIRT1的基因表达水平,线粒体OXPHOS蛋白复合物的表达水平以及血清ATP水平与HFD组相比均显著降低。HFD+CR组大鼠骨骼肌线粒体结构较HFD组完整,破坏明显减轻,线粒体嵴完整;骨骼肌OXPHOS蛋白复合物表达水平,线粒体生成基因TFAM,NRF-1,PGC-1α和SIRT1的基因表达水平显著增加。喂养32周,HFD+Leu组大鼠骨骼肌线粒体损伤较HFD组相比明显改善,线粒体包膜完整,线粒体数目增多;血清ATP水平,骨骼肌mtDNA含量以及线粒体生成基因TFAM的表达显著增加。HFD+CR组与HFD组大鼠相比骨骼肌线粒体结构完整,结构清晰;血清ATP含量显著增加。结论:在高脂环境下,膳食补充亮氨酸在胰岛素抵抗不同阶段对BCAAs的代谢,线粒体功能的影响机制不同。在高血胰岛素阶段,亮氨酸补充增加肝脏、骨骼肌和脂肪组织BCATm和BCKDK的表达,亮氨酸分解代谢产物α-酮异已酸增多,线粒体生成减少,机体抗氧化能力降低,线粒体破坏加重,线粒体功能受损。因此,在以高血胰岛素为主要特征的胰岛素抵抗阶段,虽然亮氨酸补充大鼠总的胰岛素敏感性增强,但是在高脂负荷下,亮氨酸补充促进了 BCAAs的分解,加重了线粒体负荷,影响了脂肪酸氧化,在BCAAs和脂肪酸代谢的主要组织骨骼肌表现胰岛素敏感性降低。在高血糖阶段,亮氨酸补充通过促进线粒体生成,增加机体抗氧化能力,改善线粒体结构和功能,改善了BCAAs和脂肪酸的氧化,改善了骨骼肌胰岛素敏感性。限能在两个阶段均改善线粒体功能,增加骨骼肌胰岛素敏感性。鉴于亮氨酸补充对于在胰岛素抵抗不同代谢状态下的作用,临床上应该对病人的代谢状态进行全面评价,以最大程度地发挥亮氨酸的有益作用。