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背景心律失常(包括房性心律失常和室性心律失常)发生机制包括触发活动与折返,其中触发活动与钙循环紊乱密切相关。肌浆网“钙泵”(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPases,SERCA2a)功能的受损以及兰尼碱 Ⅱ 型受体(ryanodine receptor,RyR2)功能的失衡是导致心肌钙循环紊乱的两大主要原因,而RyR2功能的失衡被认为与心律失常发生密切相关。RyR2是心肌兴奋收缩偶联时肌浆网(SR)上释放Ca2+的主要通道,它在结构上与L型钙通道偶联。心肌细胞复极时,胞外的Ca2+经L型钙通道进入胞浆,进而触发RyR2的开放,这一过程称为“钙触发钙释放”。RyR2开放主要在细胞收缩期,舒张期时只有极少数RyR2通道开放;但在肥厚或心衰心肌细胞中,RyR2通道在舒张期开放的频率增大。舒张期心肌细胞“钙漏”的增多,一方面使心肌细胞肌浆网钙容量减少,收缩时释放的Ca2+减少,心肌收缩力减弱;另一方面,增大舒张期胞浆Ca2+的浓度,舒张期Ca2+浓度的升高可使Na+/Ca2+转运蛋白活性增强以消除胞内增高的Ca2+,此过程会产生内向电流,引发后除极,增加心律失常的发生风险。RyR2受众多因子的调节和修饰,目前关于RyR2功能失衡的机制尚未完全明了。蛋白激酶A(PKA)和钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是RyR2的磷酸激酶,可分别使RyR2丝氨酸2808(RyR2-S2808)位点和丝氨酸2814(RyR2-S2814)位点磷酸化,虽然通过RyR2磷酸化可以精确调节心肌细胞生理功能,但RyR2的异常磷酸化却对心衰的发病以及心律失常的发生起重要作用。但目前有关此二位点在心脏疾病中的异常磷酸化及其对室性心律失常和房性心律失常的作用仍有较大争议,尤其是PKA介导的RyR2-S2808磷酸。因此,本研究利用大鼠腹主动脉缩窄模型,探讨CaMKⅡ介导RyR2-S2814磷酸化以及PKA介导的RyR2-S2808磷酸化水平在此模型中的变化情况,及其对室性心律失常和房性心律失常的作用;并在上述模型中探讨β受体阻滞剂对RyR2-S2808和RyR2-S2814磷酸化作用情况,以明确β受体阻滞抗心律失常的机制。本研究将为此领域的争议提供更多研究证据,并为心律失常的防治提供新思路和新策略。第一部分:PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化在肥厚和心衰早期中的变化及其对室性心律失常的作用目的:探讨PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化在肥厚和心衰早期中的变化及其对室性心律失常的作用方法:选取雄性SD大鼠,腹主动脉缩窄术制作心肌肥厚和心衰早期模型。超声心动图评价心脏功能。Elisa检测左室心肌组织cAMP浓度;Western blot技术检测左室心肌 t-CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、t-RyR2、RyR2-S2808 以及 RyR2-S2814等蛋白的表达。急性分离左室心肌细胞,激光共聚焦显微镜技术检测细胞舒张期钙火花和钙波;分别给予PKA抑制剂H89以及CaMKⅡ抑制剂KN-93后,观察其对钙火花和钙波的作用。运用Langendorff心脏离体灌流电生理技术,观察后除极的发生情况以及室性心律失常的诱发情况;分别给予KN-93与H89作用后,观察其对后除极和心律失常诱发的影响。结果:手术8w后,左室后壁舒张期厚度(LVPWd)以及室间隔厚度(IVSd)均明显增厚(P均<0.01),而左室射血分数(LVEF)以及短轴缩短率(FS)无明显变化;手术20w后,左室射血分数(LVEF)以及短轴缩短率(FS)略微有所下降(P均<0.01),故选取8w和20w为研究时间点,分别代表心肌肥厚模型(hypertrophy,Hy)和早期心衰模型(heart failure,HF)。与 Sham 组相比,Hy和HF组左室心肌组织中cAMP浓度均显著升高(P均<0.01),且HF组较Hy组有所降低(P<0.05);Hy和HF中t-CaMKⅡ和p-CaMKⅡ表达较Sham组均明显上调(P均<0.01),且HF组中p-CaMKⅡ较Hy组明显升高(P均<0.05);与Sham组相比,Hy组与HF组中RyR2表达水平无明显变化,但RyR2-S2808、RyR2-S2814水平均明显升高(P均<0.01)。CaMKⅡ抑制剂KN-93可显著抑制Hy和HF组心肌细胞钙火花的频率和幅值,且能减少Hy、HF组心肌细胞自发性钙波的发生(P均<0.01);与KN-93作用类似,PKA抑制剂H89也可明显抑制Hy、HF组钙火花的频率和幅值以及自发性钙波的发生(P均<0.01)。此外,HF组中可观察到明显的后除极和后除极引起的触发活动,而KN-93和H89均可抑制HF组中后除极和触发活动的发生。此外,KN-93和H89均能降低Hy和HF组室性心律失常的诱发率(P均<0.05)。结论:压力负荷诱导下的肥厚和心衰早期,其心室中PKA介导的RyR2-S2808和CaMKⅡ介导的RyR2-S2814磷酸化水平均明显升高,且此二位点的异常磷酸化均能促进钙漏的发生,导致后除极,增加室性心律失常的发生风险。第二部分:慢性压力后负荷下PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化在心房中的变化及其对房性心律失常的作用研究目的:探讨慢性压力负荷下PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化在心房中的变化及其对房性心律失常的作用方法:选取雄性SD大鼠,缩窄腹主动脉制作模型,选取术后20w为慢性压力后负荷升高模型(简称HF组)。Elisa方法检测心房中cAMP的浓度,Western blot 方法检测心房肌中 t-CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、t-RyR2、RyR2-S2808、RyR2-S2814表达水平。急性分离心房肌细胞,共聚焦显微镜检测心房肌细胞自发性钙火花和钙波的发生情况;给予HF组H89和KN-93作用后,观察其对钙火花和钙波的作用。运用Langendorff离体电生理技术,给予S1S2程控刺激检测有效不应期和诱发房性心律失常,并观察后除极的发生情况,Burst刺激进行房性心律失常的诱发;HF组给予H89和KN-93作用后,观察以上指标变化情况。结果:与Sham组相比,HF组心房肌中cAMP浓度显著升高(P<0.01);HF组中t-CaMKⅡ、p-CaMKⅡ以及p/t-CaMKⅡ的表达显著高于Sham组;RyR2在HF组的表达与Sham组相比无明显差异(P均<0.05),但RyR2-S2808、RyR2-S2814、表达水平明显高于Sham组(P均<0.01)。KN-93和H89均可以显著抑制HF组心房肌细胞钙火花频率和幅值以及自发性钙波的发生(P均<0.05)。此外,KN-93和H89均可延长HF组心房的有效不应期、减少后除极的发生以及降低S1S2和Burst刺激下房性心律失常的诱发率(P均<0.05)。结论:在慢性压力负荷下的心房中,PKA介导的RyR2-S2808磷酸化以及CaMKⅡ介导的RyR2-S2814磷酸化水平均明显升高,且此二位点的异常磷酸化均能导致RyR2功能受损,SR钙渗漏增多,引发后除极,增加房颤的发生风险。第三部分:美托洛尔对慢性压力负荷下心脏PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化作用研究目的:探讨β受体阻滞剂美托洛尔对慢性压力负荷下心脏中PKA和CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化的作用研究方法:选取雄性SD大鼠行腹主动脉缩窄术,分为Hy组、HF组、Hy+MT(美托洛尔,20mg/kg/d)、HF+MT(20mg/kg/d)。其中Hy、HF组在手术之后第二天开始给予生理盐水灌胃;而Hy+MT、HF+MT则给予美托洛尔灌胃,直至取材。Elisa方法检测各组左室心肌和心房组织cAMP的浓度,Western blot技术检测各组左室心肌和心房组织t-CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、RyR2-S2814、RyR2-S2808蛋白的表达。结果:美托洛而可显著降低Hy和HF组左室心肌cAMP的浓度(P均<0.01)。Hy、HF组中左室心肌中升高的p-CaMKⅡ、p/t-CaMKⅡ在使用MT之后显著降低(P均<0.01)。此外美托洛尔也可显著降低Hy、HF组中左室心肌RyR2-2808、RyR2-S2814、RyR2-S2808/RyR2 以及 RyR2-S2814/RyR2 的表达。与心室相似,美托洛尔也可减少HF组心房组织中cAMP的浓度,降低CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、p/t-CaMKⅡ、RyR2-2808、RyR2-S2814、RyR2-S2808/RyR2 以及 RyR2-S2814/RyR2的水平。结论:美托洛尔可以抑制慢性压力负荷下心脏中PKA介导的RyR2-S2808和CaMKⅡ介导的RyR2-S2814磷酸化,这可能是美托洛尔抗心律失常和预防房颤发生的重要机制