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目的:真菌性角膜炎是一种严重威胁视力的感染性角膜疾病,众多相关研究侧重于其发病机制与治疗方法,然而对正常眼表真菌群落的结构与物种多样性知之甚少,本研究旨在通过高通量测序联合培养法来初步探索人类的正常眼表真菌群落的结构与物种多样性。方法:(1)共45名健康成年人纳入本研究,并采集受试者双眼结膜囊标本,每名受试者的双眼结膜囊标本分别随机分配至测序组与培养组。(2)测序组标本经DNA提取与检测、PCR扩增、产物纯化、文库制备与库检合格后进行Miseq上机测序。Miseq测序完成后,利用overlap将原始下机的双端数据进行拼接,经质控、嵌合体过滤后获得高质量有效数据,并进行97%的相似度聚类,根据最终的OTU丰度及代表序列进行物种注释、多样性分析。(3)培养组标本接种于沙氏琼脂培养基中,置27℃恒温箱培养4周,每日观察1次,根据菌落形态特征及显微镜下菌丝与孢子特征进行菌种鉴定。结果:(1)测序组45例标本中,共18例结膜囊标本建库合格,并进行后续的ITS测序。18例标本中共产生568285个原始数据,经质控、嵌合体过滤后获得518703个有效数据,根据97%的相似度聚类为467个不同的OTU,根据每个OTU在不同标本中的丰度以及每个标本中不同OTU的序列数可得到样本的组成结构信息,经物种注释后获得眼表真菌分别在门、纲、目、科、属、种水平的菌群结构与物种多样性。(2)在门水平,共检出4个菌门,其中优势菌门为担子菌门(Basidiomycota)(78.67%,29.45%-99.39%),其次为子囊菌门(Ascomycota)(19.54%,0.39%-69.74%),接合菌门(Zygomycota)(0.13%,0-1.26%)和新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)(0.01%,0-0.05%)。(3)在纲水平,共检出19个菌纲,其中平均相对丰度>0.5%的菌纲有8个,依次为Ustilaginomycotina Incertae sedis(黑粉菌亚门分类位置未定)(74.65%,25.79%-97.43%),散囊菌纲(Eurotiomycetes)(6.22%,0.04%-56.6%),座囊菌纲(Dothideomycetes)(5.98%,0.03%-23.37%),酵母菌纲(Saccharomycetes)(5.48%,0.03%-23.37%),微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)(2.03%,0.04%-15%),粪壳菌纲(Sordariomycetes)(1.01%,0-3.76%),银耳亚纲(Tremellomycetes)(0.79%,0-5.29%)和节担菌纲(Wallemiomycetes)(0.78%,0-4.27%),共占正常眼表真菌菌群的96.94%。有9个菌纲出现在了超过50%样本中,其中Ustilaginomycotina Incertae sedis、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)在所有受检样本中均检出,酵母菌纲(Saccharomycetes)在94.44%(17/18)的样本中检出、银耳亚纲(Tremellomycetes)在88.89%(16/18的)样本中检出,粪壳菌纲(Sordariomycetes)在77.78%(14/18)的样本中检出、节担菌纲(Wallemiomycetes)在66.67%(12/18)的样本中检出。其中Ustilaginomycotina Incertae sedis、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、微球黑粉菌纲(Microbotrymycetes)、酵母菌纲(Saccharomycetes)和银耳亚纲(Tremellomycetes)共占总菌群丰度的95.15%,且在超过80%的受试者中检出,可能为正常眼表真菌群落中的核心菌纲。(4)在目水平,共检出38个菌目,平均相对丰度>0.5%的菌目有8个,分别为马拉色菌目(Malasseziales)(74.65%,25.79%-97.43%),散囊菌目(Eurotiales)(5.96%,0.04%-56.60%),酵母目Saccharomycetales(5.48%,0-68.57%),煤炱目Capnodiales(2.96%,0.01%-15.43%),格胞腔菌目Pleosporales(2.24%,0-8.46%),锁掷酵母目Sporidiobolales(2.03%,0.04%-15.00%),节担菌目(Wallemiales)(0.78%,0-4.27%)和座囊菌目(Dothideales)(0.77%,0-6.52%),共占正常眼表总真菌群落的94.87%。9个菌目在超过50%的样本中被检出,其中马拉色菌目(Malasseziales)、散囊菌目(Eurotiales)、煤炱目(Capnodiales)和锁掷酵母目(Sporidiobolales)出现在所有受试者中,酵母目(Saccharomycetales)在94.44%(17/18)的受试者中检出、格胞腔菌目(Pleosporales)在88.89%(16/18的)样本中检出,银耳目(Tremellales)在77.78%(14/18)的样本中检出,节担菌目(Wallemiales)和肉座菌目(Hypocreale s)在66.67%(12/18)的样本中检出。其中马拉色菌目(Malasseziales)、散囊菌目(Eurotiales)、煤炱目(Capnodiales)、锁掷酵母目(Sporidiobolales)、酵母目(Sac charomycetales)和格胞腔菌目(Pleosporales)共计占总菌群丰度的93.32%,且在超过80%的受试者中检出,可能为正常眼表真菌群落中的核心菌目。(5)在科水平,共检出64个菌科,其中10个菌科的平均相对丰度>0.5%,依次为M alasseziales Incertae sedis(马拉色菌目分类位置未定)(74.65%,25.79%-97.43%),发菌科(Trichocomaceae)(5.96%,0.04%-56.6%),酵母科(Saccharomycetaceae)(4.14%,0-68.31%),球腔菌科(Mycosphaerellaceae)(2.75%,0-15.02%),Spori diobolales Incertae sedis(锁掷酵母目分类位置未定)(1.95%,0-14.27%),格胞腔菌科(Pleosporaceae)(0.89%,0-4.77%),节担菌科(Wallemiaceae)(0.78%,0-4.27%),隐囊菌科(Dothioraceae)(0.77%,0-6.52%),德巴利酵母科(Debaryomycetaceae)(0.66%,0-6.93%)和Saccharomycetales Incertae sedis(酵母目分类位置未定)(0.60%,0-5.34%)。11个真菌菌科检出率超过50%,其中Malasseziales Incertae sedis(马拉色菌目分类位置未定)、发菌科(Trichocomaceae)、Sporidiobolales Incertae sedis(锁掷酵母目分类位置未定)在所有受试者中均有检出,球腔菌(Mycosphaerellaceae)在94.44%(17/18)的受试者中检出、格胞腔菌科(Pleosporaceae)在83.33%(15/18的)样本中检出,德巴利酵母科(Debaryomycetaceae)和银耳科(Tremellaceae)在77.78%(14/18)的样本中检出,酵母科(Saccharomycetaceae)和Saccharomycetales Incertae sedis(酵母目分类位置未定)在72.22%(13/18)的样本中检出,节担菌科(Wallemiaceae)在66.67%(12/18)的样本中检出,丛赤壳科(Netriaceae)在61.11%(11/18)的样本中检出。其中马Malasseziales Incertae sedis、发菌科(Trichocomaceae)、Sporidiobolales Incertae sedis、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、格胞腔菌科(Pleosporaceae)共计占总菌群丰度的87.37%,且在超过80%的受试者中检出,可能为正常眼表真菌群落中的核心菌科。(6)在属水平,共检出94个菌属,其中12个菌属的平均相对丰度>0.5%,分别为马拉色菌属(Malassezia)(74.65%,25.79%-97.43%),石座菌(Petromyces)(4.32%,0-56.31%),哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)(3.80%,0-68.29%),红酵母属(Rhodotorula)(1.93%,0.03%-14.00%),Davidiella(1.89,0-7.77%),曲霉属(Aspergillus)(1.25%,0-12.62%),节担菌属(Wallemia)(0.78%,0-4.27%),Kabatiella(0.77%,0-6.52%),枝孢菌属(C ladosporium)(0.73%,0-6.03%),Meyerozyma(0.66%,0-6.93%),交链孢属(Alternaria)(0.61%,0-3.31%)和假丝酵母属(Candida)(0.59%,0-5.34%)。在超过50%的受试者中出现的菌属有14个,其中马拉色菌属(Malassezia)和红酵母属(Rhodotorula)在所有受试者中均有检出,检出率为100%,其次为曲霉属(Aspergillus)(88.89%,16/18)、Davidiella(83.33%,15/18)、交链孢属(Alternaria)(83.33%,15/18)、Meyerozyma(77.78%,14/18)、隐球酵母菌属(Cryptococcus)(77.78%,14/18)、假丝酵母属(Candida)(72.22%,13/18)、石座菌属(Petromyces)(66.67%,12/18)、节担菌属(Wallemia)(66.67%,12/18)、散囊菌属(Eurotium)(66.67%,12/18)、枝孢菌属(Cladosporium)(61.11%,11/18)、青霉菌属(Penicillium)(50%,9/18)和酵母菌属(Saccharomyces)(50%,9/18)。其中马拉色菌属(Malassezia)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、Davidiella(83.33%,15/18)、交链孢属(Alternaria)(83.33%,15/18)共计占总菌群丰度的80.33%,且在超过80%的受试者中检出,可能为正常眼表真菌群落中的核心菌属。(7)在种水平,共检出113个菌种,有9个菌种平均相对丰度>0.5%,其中丰度最高的菌种为Malassezia restrica(55.39%,2.21%-90.81%),其次为Malassezia globose(5.29%,0.22%-20.78%),黄曲霉(Aspergillus flavus)(4.27%,0-55.76%),土壤哈萨克斯坦酵母(Kazachstania telluris)(3.80%,0-68.29%),胶红酵母(Rhodotorula mucilaginasa)(1.67%,0.03%-13.94%),Cladosporium haloterans(0.73%,0-6.03%),链格孢菌(Alternaria alternate)(0.61%,0-3.31%),蜜生节担菌(Wallemia mellicola)(0.61%,0-4.27%)和A spergillus vitricola(0.52%,0-5.92%)。在超过50%的受试者中出现的菌种有11个,其中Malassezia restricta、Malasse zia globose和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)在所有受试者中均有检出,检出率为100%,其次为链格孢菌(Alternaria alternate)(83.33%,15/18)、黄曲霉(A spergillus flavus)(61.11%,11/18)、Cladosporium halotolerans(61.11%,11/18)、帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)(61.11%,11/18)、斯鲁菲亚红酵母(Rhodoto rula slooffiae)(61.11%,11/18)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)(50%,9/18)、大隐球酵母(Cryptococcus magnus)(50%,9/18)、匐生曲霉(Aspergillus rep tans)(50%,9/18)。(8)培养组45例标本中,共4例标本真菌培养阳性,分别为橘青霉、黑曲霉、瓶霉、木霉。结论:1、本研究应用高通量测序联合培养法对正常眼表的真菌进行了初步探索,增加了对眼表真菌群落的认识,为进一步研究眼表菌群和眼健康与疾病的关系提供了基础。2、与培养法相比,高通量测序法对眼表真菌群落的鉴定更具多样性,而且可对眼表真菌群落的结构进行更全面地分析。