一、研究背景与目的湿疹是常见的变态反应性炎症性皮肤病,临床特点表现为剧烈瘙痒,有多形性皮疹及渗出倾向,易于复发并趋向慢性化。由于湿疹的病因复杂多样,发病机制不清,治疗效果不甚理想,严重影响患者的生活质量。目前有关湿疹发病机制的研究主要集中在T辅助细胞(Th,T helper)亚群功能失衡和寻求可能存在的变应原两个方面,虽取得一些进展,但对于湿疹的发病机制始终未能明确。2000年以来,湿疹患者皮损局部的炎症介质,尤其是白三烯(leukotrienes, LTs)类物质日益受到关注。半胱氨酰白三烯(Cysteinyl leukotrienes, CysLTs)作为众多炎症反应的最终直接效应物质,不仅可使平滑肌收缩、毛细血管扩张、腺体分泌增加,还是一种重要的细胞因子调控剂,并与其他多种炎性递质间具有广泛的相互作用,同时,CysLTs还可参与包括肿瘤细胞在内的多种细胞的增殖与分化调控。因此,CysLTs在多种炎性疾病发病过程中发挥了关键性作用。然而,在不同的疾病和不同的组织细胞,CysLTs所发挥的生物学活性差别很大,这与其受体的分布和功能存在着必然的联系。研究CysLTs在湿疹发病机制的作用,就不可能忽视其受体在皮肤组织中的表达与功能。半胱氨酰白三烯受体(Cysteinyl leukotriene receptor, CysLTR)属G蛋白偶联受体,根据是否对现有拮抗剂敏感被分为CysLTR1和CysLTR2两型。CysLTR1和CysLTR2的全基因克隆已分别于1999和2000年完成,二者相似性较低(仅38%)。该受体在人体多种组织细胞上表达,尤其是嗜酸细胞、脾细胞、平滑肌细胞等,但两型受体的表达并非完全平行,有关CysLTR在皮肤组织中表达、分布与功能的研究迄今少有文献报道。过去对湿疹的研究较多关注于外周血单一核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),认为其生物学行为的改变以及由此带来的Th亚群失衡是湿疹主要的病理生理变化。而角质形成细胞(keratinocyte,KC)是表皮的主要组成细胞,也是机体首先接触各种外源性物质的组织结构.尽管传统的观点认为KC仅仅在人体与外部环境之间起一个屏障作用,但新近研究发现KC不仅在皮肤炎症调节过程中起重要作用,还具有非特异性吞噬功能外及抗原提呈细胞的功能,其生物学行为的改变将直接影响到众多皮肤病的发生和转归,因此也成为治疗的重要靶标。如果能够了解CysLTs在湿疹患者体内水平的变化,进而了解其受体在皮肤组织甚至在KC中的表达状况与功能,必将对于准确评价CysLTs在湿疹发病机制中的作用和地位以及寻求新的治疗靶位和方法具有积极的意义。二、方法与结果1.采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)、反相高压液相色谱法(reversed-phase high pressure liquid chromatography,RP-HPLC)检测10例亚急性湿疹患者外周血、尿液及皮损组织中LTs水平,并在咪唑斯汀(10mg 1/日)治疗5天后复查上述指标,治疗前后均按改良EASI评分法作临床评分。结果发现:①湿疹患者外周血LTB4、LTC4和尿液中的LTE4显著高于正常对照(P<0.01),皮损组织中LTB4、LTC4和LTE4也显著高于正常对照(P<0.01),提示LTs参与了湿疹的病理生理过程。②咪唑斯汀可显著降低湿疹患者外周血LTB4水平(t=2.851, P<0.05)及皮损组织中LTB4、LTC4和LTE4水平(P<0.05)。③外周血IFN-γ与皮损组织中LTB4变化趋势一致,外周血LTB4与皮损组织中LTB4变化趋势一致,Pearson相关系数分别等于0.844,0.674,P<0.01,具有非常显著的统计学意义。提示LTs可能不仅作为趋化因子和效应物质参与炎症反应,而且还能与IFN-γ发挥协同作用从而放大炎症反应。2.采用逆转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与免疫组化技术检测正常人皮肤组织及亚急性湿疹和寻常型银屑病患者皮损组织中CysLTRs的表达。首次证实了皮肤组织中存在CysLTR1和CysLTR2的表达,主要分布于表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺、血管壁和平滑肌,两型受体在表达量和分布上没有显著差异;亚急性湿疹和寻常型银屑病患者皮损处CysLTR1和CysLTR2的表达显著高于正常对照(P<0.05),但两型受体在表达量和分布上没有显著差异。结果提示LTs参与湿疹、银屑病等炎症性皮肤病的发病有其受体存在的作用基础。3.建立聚碳酸酯膜分隔的PBMC与KC非接触式共培养模型,水溶性细胞因子和黏附分子可在两种细胞间自由流通发挥作用,而脂溶性的LTs则几乎不能通过。采用ELISA法检测KC培养上清中LTs的水平,以初步了解PBMC对KC合成LTs的影响。结果发现单独培养的KC培养上清中LTs的水平较低,正常人PBMC与KC共培养后培养上清中LTB4升高显著,湿疹患者PBMC与KC共培养后培养上清中LTB4升高则更为显著,三组间两两比较,P值均小于0.01。同时,我们还观察到IL-2和IFN-γ刺激也可促进单独培养的KC合成LTB4(P<0.01)。提示PBMC可能通过IL-2、IFN-γ等水溶性细胞因子促进KC合成LTB4。4.采用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察、免疫印迹(western-blot)等方法检测KC上CysLTRs的表达;通过Fura-2/AM法检测胞内钙流、MTT法检测细胞增殖活性来了解KC上CysLTRs的功能。①首次证实了KC上存在功能性CysLTR1和CysLTR2的表达,主要分布于细胞膜、细胞浆和部分胞核;②LTD4可诱导CysLTR1发生核转位,明显延长KC的指数生长期,提高其增殖活性,而受体拮抗剂MK571和BAYu9773可阻断这些改变。可提示LTD4可能通过其受体发生核转位参与了KC的增殖调控,但确切机制还需进一步研究证实。三、结论1. LTs作为一类强效炎症介质参与了湿疹的发病过程。2. KC作为表皮的主要构成细胞不仅可以合成CysLTs,而且由于其表达CysLTRs而成为CysLTs在皮肤中作用的靶细胞之一;炎症状态下,KC合成CysLTs与表达CysLTRs均显著增强。3.炎症状态下CysLTR1发生核转位可能是CysLTs促进KC增殖的重要机制。通过以上实验,为准确评价CysLTs在湿疹发病机制中的作用和地位,寻求新的治疗靶点奠定了必要的实验基础。