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肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae）是引起奶牛乳腺炎的主要环境性致病菌之一,且发病率和检出率逐年提高。硒是哺乳动物生长发育所必需的一种微量元素,参与机体硒蛋白的组成,发挥抗氧化和抗炎等作用。硒代蛋氨酸（Selenomethionine,SeMet）是奶牛养殖业中一种常见的饲料添加剂,与无机硒相比,其更易被动物机体吸收利用。本试验旨在探究K.pneumoniae侵袭致奶牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary epithelial cells,MAC-T）损伤的机制,以及硒对K.pneumoniae侵袭的MAC-T的保护作用,为临床上K.pneumoniae引发的奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。（1）为探究K.pneumoniae侵袭MAC-T对炎症和氧化应激的影响,本试验使用K.pneumoniae以MOI=10:1侵袭MAC-T,建立细胞感染的体外模型。分别在侵袭后 15 min、30 min、45 min、60 min、90 min 和 120 min 检测 NF-κB 信号通路相关蛋白表达,并于侵袭后1h、2h、3h、4h和5h检测相关炎性因子基因、Nrf2信号通路关键基因表达,以及相关抗氧化酶的活性。结果显示:IκBα的磷酸化水平在侵袭的15 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min呈显著或极显著上升（p＜0.05或p＜0.01）;p65的磷酸化水平在侵袭的15 min、30min、45 min、60 min、90 min和120 min呈极显著上升（p＜0.01）;IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达在侵袭的1h、2h、3h、4h和5h均呈显著或极显著增强（p＜0.05或p＜0.01）;Nrf2和NQO1基因表达在侵袭的1 h呈极显著上升（p＜0.01）;在侵袭后3 h、4 h和5 h,Nrf2,NQO1和HO-1基因呈显著或极显著下降（p＜0.05或p＜0.01）;活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平在侵袭的3 h、4 h和5 h均呈显著或极显著提高（p＜0.05或p＜0.01）;过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases,GSH-PX）活性在侵袭的3 h、4h和5h均呈显著或极显著下降（p＜0.05或p＜0.01）,细胞总抗氧化能力（Total antioxidative capability,T-AOC）也在侵袭的 2h、3h、4h 和 5h 呈显著或极显著下降（p＜0.05 或p＜0.01）。（2）为探究ROS在K.pneumoniae侵袭MAC-T中的作用,本试验通过建立 K.pneumoniae感染模型,使用5 mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）与 MAC-T 共孵育后,在侵袭的 1 h,检测 NF-κB信号通路关键蛋白表达的变化;在侵袭的4h,检测相关炎性因子基因表达、Nrf2信号通路关键基因表达、相关抗氧化酶活性及ROS和MDA水平的变化。结果显示:与K.pneumoniae组相比,NAC干预组的ROS及MDA水平极显著降低（p＜0.01）,Nrf2、NQO-1和HO-1基因表达呈显著或极显著上升（p＜0.05或p＜0.01）,Keap1基因表达呈极显著下降（p＜0.01）,CAT、SOD和GSH-PX活性及T-AOC水平均呈极显著上升（p＜0.01）;与K.pneumoniae组相比,NAC干预组的IκBα和p65蛋白的磷酸化水平呈极显著下降（p＜0.01）,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α基因表达均呈极显著下降（p＜0.01）。（3）为探究SeMet对K.pneumoniae侵袭MAC-T的炎症和氧化应激的影响,本试验通过建立K.pneumoniae感染模型,使用4 μmol/L的SeMet与MAC-T共孵育后,在侵袭的1 h,检测NF-κB信号通路关键蛋白表达的变化;在侵袭的4h,检测相关炎性因子基因表达、Nrf2信号通路关键蛋白和基因表达、相关抗氧化酶活性、ROS和MDA水平及Nrf2蛋白定位的变化。结果显示:与K.pneumoniae组相比,SeMet干预组IκBα和p65蛋白磷酸化水平均呈极显著下降（p＜0.01）,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α基因表达均呈极显著下降（p＜0.01）。与K.pneumoniae组相比,SeMet干预组Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表达及基因表达均呈显著极显著上升（p＜0.05或p＜0.01）,Keap1蛋白表达和基因表达均呈显著或极显著下降（p＜0.05 或p＜0.01）。与 K.pneumoniae 组相比,SeMet 组 ROS 和 MDA 水平呈极显著下降（p＜0.01）,CAT、SOD、GSH-PX活性及T-AOC水平呈极显著升高（p＜0.01）。与空白组相比,K.pneumoniae组核内Nrf2蛋白荧光强度减弱;与K.pneumoniae组相比,SeMet干预组核内Nrf2蛋白荧光强度增强。综上所述,K.pneumoniae侵袭MAC-T可激活NF-κB信号通路,并可在侵袭后期抑制Nrf2信号通路的表达,对细胞造成严重的炎性和氧化损伤;同时,K.pneumoniae侵袭MAC-T产生的ROS可作为炎症介质增强炎症反应,加剧炎性损伤;而SeMet可通过下调NF-κB信号通路,降低炎性因子表达,减轻炎性损伤;并可通过负调控Nrf2信号通路,促进Nrf2蛋白入核表达,增强抗氧化酶活性,降低ROS及MDA水平,减轻氧化损伤。