在正常人体循环系统中，血液中的血小板都是未激活，多数处于静息状态的水平。血小板发生活化是静息状态下的血小板在受到各种物理、化学或生物因子的作用下，使得血小板受到刺激而被激活成为活化的血小板。只有静息状态下的血小板发生活化后，血小板才能发生粘附、变形、聚集、释放等一系列的生理过程，形成斑块，最终导致血栓的形成。血小板糖蛋白的种类较多，其中最主要的糖蛋白是PAC-1和CD62P两种。上述两种糖蛋白的生理作用分别是，PAC-1是纤维蛋白原受体，它主要是参与纤维蛋白原的结合，促使血小板产生聚集反应。CD62P则是通过介导血液中的细胞与细胞之间（如中性粒细胞、单核细胞与血小板或内皮细胞）发生相互的粘附、聚集的过程，以上两种糖蛋白在形成血栓和血液细胞之间的炎症反应中起到重要的作用。当血小板发生活化后，血小板糖蛋白表面的CD62P、PAC-1表达能力比原来明显增强，并且成为血小板活化的标志物。本实验通过流式细胞术来检测血小板膜上的CD62P、PAC-1的阳性表达率，我们可以了解到血小板活化的程度。在本实验中,我们通过检测老年TIA患者的PAC-1、CD62P活化水平进行分析和研究，同时行颈动脉血管彩超检查，分别来观察老年TIA患者血小板活化程度的变化及伴有颈动脉粥样硬化各项指标的变化。进一步分析老年TIA患者活化的血小板水平伴有颈动脉粥样硬化发病中的作用，并且通过实验再次证实血小板活化标志物CD62P、PAC-1的表达情况，并与健康对照组比较，明确老年TIA伴颈动脉粥样硬化与血小板活化之间的关系，为预防TIA的发生及再发、干预TIA病程进展寻找新的方法。一.材料和方法：研究对象：与泰安市中心医院查体中心合作，系2010年度泰安市老干部健康查体信息资料中，从中选取正常体检者50例。男性32例，女性18例，平均年龄为65.4±6.9岁。来用于检测血小板活化蛋白CD62P和PAC-1活化程度，并作为实验中老年TIA组的健康对照组。健康对照组中,正常体检者均要求排除既往患有心、脑血管疾病，呼吸、消化系统疾病，泌尿系统疾病、高血压病，糖尿病，慢性感染，肿瘤疾病，风湿免疫性疾病，近期手术、活动性出血及有出血倾向等疾病病史的查体者。并给予常规辅助检查项目，如血常规，肝、肾功，血脂，血糖，凝血系统，大、小便常规，心电图，胸片等检查结果均未见明显异常。搜集泰安市中心医院老年二科病房，自2010年10月至2012年02月期间住院，患有TIA的患者74例。男性52例，女性22例，平均年龄67.4±6.2岁。作为实验中老年TIA组。排除标准：1.既往患有糖尿病，急性脑血管病，心房颤动等心源性梗塞疾病。2.患者入院前2周服用过阿司匹林，氯吡格雷，肝素等影响血小板功能此类的药物。3.既往有食管，胃底静脉曲张或活动性溃疡的疾病等。血小板活化蛋白的检测：老年TIA组的患者入院后，于第一次发病时间至发病后24h内，48h，7d和14d时各抽取肘前静脉血1次，分别用于检测血小板活化蛋白CD62P、PAC-1各时间段的活化水平。实验方法：老年TIA患者入院后，采集血标本时必须使用一次性采血针，每次抽取静脉血均要求一针见血。所有受试者次日晨起后空腹，选择穿刺肘正中静脉，抽取静脉血约2ml，为防止血小板发生活化，抽血时不予扎止血带。为防止血液凝固，影响实验最终结果,把血标本置于抗凝真空采血管中，血液与抗凝剂的比例为9:1，为使血液与抗凝剂充分混匀，轻轻摇晃采血管。在抽完血标本10分钟内必须完成实验室染色等操作步骤。实验荧光染色方法：1.首先在实验对照管中分别加入IgG1PE、PAC-1、CD61PerCP荧光抗体各20μL，再加入RGDS试剂10μL。2.然后在试验管中分别加入PAC-1FITC，CD62P PE，CD61PerCP荧光抗体各20μL；再在对照管和试验管中各加入鲜血标本5μL，使血液标本与各种试剂轻轻混匀后，放在实验室阴暗处、避光保存15-20分钟左右。3.在对照管和试验管中分别各加入预冷的1%多聚甲醛固定液（2～8℃）1ml，充分混匀后，再置于2～8℃的阴暗，避光处放置30分钟左右。4.最后在取完血标本后，立即完成实验室染色步骤。在12h内，进行流式细胞仪的上机实验操作。流式细胞仪各参数的设定，设定血小板门，要以CD61PerCP和散射光测量后的散点图为标准。按实验要求同型对照设定为阴性。进行流式细胞仪操作，实验顺利最终测定出血小板活化蛋白PAC-1、CD62P阳性百分率。5.用同样的实验方法，进行检测50例健康对照组患者的血小板活化特异性分子标志物PAC-1和CD62P的阳性百分率。颈动脉彩色多谱勒超声检测：1、所有行颈动脉彩超的受试者均采用泰安市中心医院彩超室，由美国GE公司生产的vivid seven型彩色多谱勒超声探测仪，给予颈动脉彩超检查，选择频率为5-12MHz的探头。2、专门由一位经验丰富的超声技师负责颈动脉彩超检查的操作及其影像学诊断。3、检查方法：(1)所有受试者行颈动脉彩超检查前，嘱其受试者静坐或平躺休息5分钟左右。(2)所有受试者检查的体位均采用仰卧位。嘱受试者全身放松，平躺，双肩下垫枕，头尽量后仰，充分暴露出颈部，行一侧颈动脉检查时，头偏向对侧。(3)颈动脉彩超检查方法：先将探头及需检查部位涂上耦合剂，探头轻轻放置颈根部，即锁骨上缘，气管旁开始检查，根据颈动脉走形，先进行颈动脉的纵切探查，然后再从颈总动脉的近端，沿血管的走向继续往上移动探查，移动至动脉的分叉处。在检查操作中尽可能的探查到进颅前动脉的最高点。在彩超检查中，分别探查到的动脉有颈总动脉(CCA)近端、颈总动脉中段和颈总动脉远端，颈内动脉和颈外动脉，以及椎动脉和锁骨下动脉。(4)颈动脉彩超检查内容：所有受试者均行颈动脉内-中膜厚度(IMT)、颈动脉斑块及斑块性质的探查。选择频率为5～12MHz的探头,选取需要探查的部位，确定在颈动脉球部近端1cm总动脉段处，颈动脉分叉部，球部远端1cm颈内动脉后壁处这三个部位，左右两侧各取3个点，分别测量3次，检查后统计检查的数据，最后取各检查部位数据的平均值。实验中，定义为颈动脉粥样斑块有两个条件，1.血管局部的IMT值>1.2mm；2.血管内血流缺损的面积≥10mm2。影像诊断学中，强回声影为硬斑，低回声影则为软斑。4、根据彩色多谱勒超声检查的结果，分为伴有动脉粥样硬化的TIA组与不伴动脉粥样硬化的TIA组，对照组分为伴动脉粥样硬化的对照组与不伴动脉粥样硬化的对照组。二.统计学处理本实验利用SAS统计学软件，对各组数据进行统计学分析。各组数据以均数±标准差(±S)表示。各组组内的数据均采用方差分析。老年TIA组患者与血小板活化水平之间的相关性分析，应用pearson相关系数分析数据。实验数据中，P<0.05认为有显著性差异，P＞0.01认为有非常显著性差异。伴CA的老年TIA组、不伴CA的老年TIA组、伴CA的对照组和不伴CA的对照组，这四组的PAC-l、CD62P的阳性率均数比较，利用F+q检验。PAC-1、CD62P的阳性表达率与颈动脉粥样硬化斑块以及斑块的性质关系的比较均采用t检验。PAC-1、CD62P的阳性表达率与受试者的年龄、性别、血小板计数、血压之间有无关系，采用偏相关性分析。三.结果1、老年TIA组与正常对照组PAC-1、CD62P阳性表达率的比较：老年TIA组PAC-1、CD62P阳性表达率较正常对照组明显增高，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。2、老年TIA伴或不伴颈动脉粥样硬化组与健康对照组的比较：（1）.老年TIA组中伴有或不伴有颈动脉粥样硬化的TIA患者，其PAC-1、CD62P阳性表达率显著高于相应的对照组；两组比较之间的差异有统计学意义（P<0.01）。（2）.在老年TIA组或健康对照组中，伴有颈动脉粥样硬化PAC-1、CD62P阳性表达率明显高于无颈动脉粥样硬化组，并且以伴有颈动脉粥样硬化的老年TIA组最高。两组比较之间的差异有统计学意义（P<0.01）。3、老年TIA、颈动脉粥样斑块与PAC-1、CD62P阳性表达率的关系：在伴有颈动脉粥样硬化的老年TIA组中，有粥样斑块组的PAC-l、CD62P阳性率明显高于无粥样斑块组。两组比较之间的差异有统计学意义（P<0.01）。4、老年TIA、颈动脉粥样斑块性质与PAC-l、CD62P阳性表达率的关系：伴有颈动脉粥样斑块的老年TIA组中，伴有不稳定斑块TIA组的PAC-1、CD62P阳性表达率明显高于稳定斑块组。两组比较之间的差异有统计学意义（P<0.01）。结论实验研究中，为进一步明确老年TIA患者与血小板膜糖蛋白之间的关系，本实验设计采取PAC-1和CD62P作为检测血小板活化程度的标志物。通过实验结果表明，在老年TIA组中PAC-1和CD62P的水平比正常相应对照组的阳性表达率明显升高。在老年TIA组中，PAC-1和CD62P的水平随颈动脉内膜病变程度的加重而逐渐升高。这表明，老年TIA患者中必然存在着血小板活化，而且PAC-1和CD62P的水平随颈动脉受损程度的加重而升高。考虑可能有两个原因，一是患者发生颈动脉粥样硬化后，血管内皮受到不同程度的损伤，导致其中的胶原组织及凝血酶等物质的大量产生，促使血小板本身的形态及结构都发生了改变，再以钙离子的形式同细胞内的磷酸化发生反应。二是颈动脉粥样斑块大量黏贴在血管的管壁上，通过长时间的聚集，最终形成大小不一的团块，可造成血管局部官腔内的狭窄，使得血液流动受阻，血流速度减慢以及流动形态发生改变，此时血流速度受到的剪切力明显高于正常生理水平。所以，高剪切力的作用也可以让血小板膜表面的PAC-1和CD62P的表达水平发挥出更大的作用。通过本研究还发现，血小板活化程度的高低与颈动脉粥样斑块的性质也有一定的相关性。老年TIA伴有不稳定斑块组与稳定斑块组对比较，明显可以发现伴有不稳定斑块组的PAC-1和CD62P表达明显高于稳定斑块组。其原因可能是因为老年TIA患者动脉血管管壁上的不稳定斑块具有它不稳定性的特点，导致斑块极易发生脱落，脱落到血管腔内，随血液流动，而血小板是黏附在不稳定斑块的表面，促进血小板活化与PAC-1和CD62P的大量释放。所谓血栓前的状态，可以简单理解为就是血液发生高凝时的状态，它是因为血管内皮细胞受损后，血液内的血小板和白细胞被激活，相应的凝血因子得到了活化的机会，促使纤溶系统降低，病理状态发生改变，最终形成血栓。实验发现，老年TIA组患者的血小板活化水平较正常对照组明显升高，并且颈动脉粥样硬化程度的加重，影响血小板活化水平升高。通过实验及相关文献发现，通过检测老年TIA患者的血小板活化程度，对颈动脉粥样硬化的判断有很大诊断，可以给予早干预、早发现、减少TIA反复发作的频率以及预防进展为脑梗死有重要意义。