1．目的 丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一种高水溶性的小分子α，β一不饱和羰基化合物，能经皮肤迅速吸收，工业上主要用于生产其聚合物—聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺是一种工业絮凝剂，广泛应用于饮水净化、污水处理、食品加工、造纸和采矿业，丙烯酰胺单体则在建造堤坝、地基、隧道和公路中用于生产水泥和土壤的稳定剂，它在粘合剂和纺织品制造业以及胶片冲印中也有应用。世界上，在工业加工中接触AA的工人数以万计，在分子生物学实验室，这一数值估计高达10—20万。最新研究报道，在淀粉类及肉类食品被加热时可产生AA，这就表明在烹饪和日常饮食中人们都可能暴露于AA。不同于其无毒的聚合体，AA单体能够引起多种毒性效应，对人类还具有潜在致癌和致突变的危险。因此，迫切需要进一步研究并阐明AA对人类的基因毒性和致癌性，并明确其作用机制。 AA具有广泛的毒性作用，包括神经毒性、生殖毒性、发育毒性、潜在的基因毒性和致癌性。近年来，AA的基因毒性和致癌性效应引起科学家们越来越多的关注，各国学者对其进行了多项实验研究。在哺乳类细胞体外试验中，AA诱导染色体结构畸变和有丝分裂紊乱，但细胞转化和2003年浙江大学硕士学位论文5 ”基因突变结果多为阴性；在体内，AA诱导大鼠精母细胞、小鼠生殖细胞 和人乳房上皮细胞程序外DNA合成（UDS）的发生，但该试验结果在大鼠肝 细胞报道为阴性，AA还诱导小鼠骨髓有丝分裂前期和后期的细胞染色体 畸变和微核形成、可遗传的易位、特异位点突变和大、小鼠显性致死性 突变。此外，AA可诱导果蝇属性染色体连锁的隐性致死性突变和体细胞 突变，但在细菌，如沙门氏菌、肺炎克雷白杆菌、大肠埃希氏杆菌等的 突变试验中即使加入体外活化系统并以高浓度剂量处理仍呈现阴性反 应。在动物实验中，Bllll等 1984年以管饲法、腹腔注射和背部皮肤局部 染毒三种途径处理小鼠时首次发现AA的致癌效应。之后，其致癌作用在 大鼠饮水摄入AA的慢性毒性试验中也得到证实。 由于动物实验已证实AA的致癌性，但根据暴露工人的流行病学调查 资料还不足以得出AA与人类癌症关联的确切结论，因此，世界卫生组织 下属的国际癌症研究所（ARC）将M 确定为“probab办 caminogenic to humans”即：人类可能致癌因素。 很多研究发现AA诱导可遗传的遗传损伤，比如染色体畸变和姐妹染 色单体交换等，但在DNA损伤和基因突变研究中阳性与阴性结果均有报 道。现在仍难以解释的一个现象是：尽管AA在一些体内、体外实验中显 示出具有与DNA直接加合的活性，但无论有无微粒体活化系统存在，其 Ames试验始终为阴性结果。迄今为止，关于AA致突变作用的机制的研究 非常有限。有研究者报道AA在体外与DNA的反应非常微弱，仅在以高浓 度剂量的AA处理细胞几周后才能观察到显著性水平的DNA加合物产生， 因此提出AA的基因毒性和致癌性效应是其与蛋白质相互作用的结果。 最近发现，AA可能经细胞色素P450（CYP450）ZEI代谢为环氧丙酚胺（GA）， 研究显示AA经CYP450代谢形成的环氧化物GA表现出与AA同样的诱导 显性致死效应和可遗传的易位的作用。因此，作者提出AA的断裂剂效应 不完全是其自身的作用，而可能部分归因于GA的DNA反应活性。总之， AA的基因毒性和致癌性机制仍处于争议中。 山于引起职业性AA中毒的主要途径是经皮肤吸收，流行病学调查显2003年浙江大学硕士学位论文6 示职业性AA暴露能致不同程度的皮肤损害，引起皮肤角化过度、脱屑、 湿疹、牛皮癣等，还可能是造成皮肤乳头状瘤发生率较高的原因。为此， 本实验选用细胞特性与正常角质细胞相似的良性人角质形成细胞株 HaCaT细胞为模型，研究AA对人皮肤角质形成细胞的细胞毒性和DNA损 伤效应及其可能的作用机制，从而实验结果更接近人类皮肤暴露于AA的 真实情况。 本实验应用MTT比色法和单细胞凝胶电泳分析（SCGE）观察： （1MA是否是HaCaT细胞的细胞毒性剂 （2川A能否损伤HaCaT细胞的DNA （3）HaCaT细胞中CYP450的代谢作用是否为AA诱导DNA损伤所必需。 二．材料与方法 HaCaT细胞是来源于成人皮肤角质形成细胞的一个自发转化的人上皮 细胞株，其生长具有明显的‘不死性’，但除此无限生长的特性而外，该 细胞株与正常的人角质形成细胞表现极为相似的特性。因而对于观察人 皮肤细胞暴露于各种理化因素的反应是一个很有效的细胞模型。在本实 验中，HaCaT细胞用于研究AA的细胞毒作用和DNA损伤效应。HaCaT细 胞以 l．SX10’个／cm’密度接种培养Illl，于37℃、5％CO。条件下常规培养 于完全培养基（DMEM，10％胎牛血清）中，用胰酶一依地酸盐混合溶液消 化传代，每三天传代一次。 2＊ 第一部分： 丙烯酞胺对人皮肤细胞的细胞毒性和DNA损伤作用 ＊1＊细胞毒性试验（MTT法） 细胞接种96孔培养板，常规培养24小时后，按不同浓度在剂量组各 孔内加入 AA至终浓度分别为 0．25、0．5、0，75、I、2、