阿尔茨海默病(AlzHEimer’s disease,AD)是老年人群中最常见的一种慢性进行性中枢神经系统退行性疾病,主要临床表现为记忆力下降、计算力下降、定向力障碍、语言障碍、理解力判断力下降、情感与行为障碍等,并且这些症状严重影响患者及家属的日常生活。AD大多为散发形式,也可表现家族性AD,而家族性AD多呈常染色体显性遗传。目前已确定的家族性AD突变基因有早老素1(Presenilin 1,PS1)基因、早老素2(Presenilin 2,PS2)基因、淀粉样前体蛋白基因(Amyloid precursor protein,APP)以及载脂蛋白E4(Apolipoprotein E4,ApoE4)等位基因。AD的主要病理学改变有神经炎性斑块、神经元纤维缠结、神经元减少、神经元间的突触丢失、细胞颗粒空泡变性和淀粉样蛋白脑血管变化等。关于其发病机制,有很多种学说,目前比较公认的为“Aβ级联反应学说”,Aβ的异常沉积可导致线粒体损伤、氧化应激反应激活、进一步促进了Tau蛋白的过度磷酸化,最终诱发细胞调亡。APP经β和γ分泌酶剪切可以形成Aβ,Aβ分为可溶性片段及不可溶片段,其中不可溶片段可造成细胞损伤。PS1、PS2及APP等基因的突变可使不可溶性片段增多,触发Aβ级联反应。另外,AD的发病机制还表现为免疫功能异常,主要为小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活和脑内某些脑区炎性细胞因子水平的过度增高。活化后的小胶质细胞具有抗原呈递和吞噬功能,可以介导炎症反应引起神经元损伤。1996年研制出了APP/PS1转基因小鼠动物模型,含有嵌合的小鼠/人类家族性AD基因APP和PS1。APP/PS1转基因小鼠动物模型可模拟人类阿尔茨海默病神经组织内Aβ斑块的形成和小胶质细胞增多的现象,对于理解疾病的病因和验证新的治疗方法的疗效尤其重要。代谢组学在阿尔茨海默病的诊断中同样起到了重要作用,例如在AD患者和转基因AD的动物模型的大脑内都发现了明显的糖代谢下降,且发生于典型病理变化出现之前。虽然目前有许多AD的转基因动物模型,但双转基因APP/PS1小鼠的氧化应激损伤相对较严重。因此,利用此动物模型可以评价抗氧化药物的疗效。丹参多酚酸(TSA)注射液是从丹参这种传统中药中提取的有效成分的水溶性多酚化合物。既往的研究证明,丹酚酸主要的作用是清除多种自由基,具有确切的抗氧化作用。本课题应用APP/PS1转基因ad小鼠,进行了丹参多酚酸持续14周的腹腔注射,研究其对学习和记忆力的影响,并进一步从代谢组学、病理变化、小胶质细胞炎症反应等角度探讨了该药物的作用机制。第一部分丹参多酚酸改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习和记忆的行为学研究目的:通过动物行为学实验观察丹参多酚酸是否改善APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力。方法:1将30只雄性APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1模型组(0.4ml/d生理盐水腹腔注射),低剂量丹参多酚酸治疗组(0.4ml30mg/kg·d丹参多酚酸注射液腹腔注射),高剂量丹参多酚酸治疗组(0.4ml60mg/kg·d丹参多酚酸注射液腹腔注射),同窝10只雄性APP-/PS1-的野生型小鼠(wt)作为正常对照组(0.4ml/d生理盐水腹腔注射)。2四组小鼠均从3.5月龄开始给药,每天给药1次,连续给药14周,实验期间每周测试一次小鼠体重,根据小鼠体重调整每周用药剂量。3给药14周后进行新异物体识别实验、morris水迷宫实验及避暗实验。记录新异物体偏爱指数、定位航行实验平均寻台潜伏期,探索实验的穿越原平台频次及穿越原平台象限时间百分比,避暗逃避潜伏期等,评估各组小鼠学习记忆能力。动物行为学实验期间,各组小鼠均不实施任何形式的干预。结果:1新异物体识别实验训练期后1h时,与正常对照组相比较APP/PS1模型组小鼠对新异物体的偏爱指数明显下降(p<0.01)。与模型组比较,丹参多酚酸治疗后可提高APP/PS1小鼠对新异物体的偏爱指数(30mg/kgTSA,p<0.01;60mg/kgTSA,p<0.05)。训练期后24h实验各组小鼠对新异物体的偏爱指数之间无明显差异[f(3,40)=0.611,p=0.612]。2morris水迷宫的定位航行实验前3天,四组的平均逃避潜伏期无明显差异(p>0.05)。定位航行实验的第4、5天,APP/PS1模型组平均逃避潜伏期均明显增加(p<0.01)。与APP/PS1模型组比较,定位航行的第4、5天两种剂量的丹参多酚酸组小鼠平均寻台潜伏期均明显缩短[(day4:30mg/kgTSA,p<0.01;60mg/kgTSA,p<0.05);(day5:30mg/kgTSA,p<0.01;60mg/kgTSA,p<0.01)],同时寻找站台策略均有改善。morris水迷宫的空间探索实验中,与正常组相比较,APP/PS1模型组小鼠寻觅原站台位置潜伏期明显延长(p<0.01)。丹参多酚酸的干预不仅显著缩短了APP/PS1双转基因小鼠寻觅原站台的时间(p<0.01),而且与正常组相比无明显差异(p>0.05)。APP/PS1双转基因小鼠穿越原站台位置频次低于正常对照组(p<0.05)。丹参多酚酸的治疗提高了APP/PS1双转基因小鼠穿越原站台位置的频次(30mg/kgTSA,p<0.01;60mg/kgTSA,p<0.05)。与正常对照组相比较,APP/PS1模型组小鼠通过靶向限的时间百分比缩短(p<0.01)。丹参多酚酸的治疗提高了APP/PS1小鼠通过靶向限的时间百分比(30mg/kgTSA,p<0.05;60mg/kgTSA,p<0.01)。3避暗实验结果显示,APP/PS1小鼠的逃避潜伏期较正常对照组明显缩短(p<0.01)。丹参多酚酸的治疗提高了APP/PS1小鼠受电击后24h的逃避潜伏期(30mg/kgTSA,p<0.01;60mg/kgTSA,p<0.05)。第二部分丹参多酚酸调节APPswe/PS1dE9双转基因小鼠血浆及海马组织的代谢物质目的:观察经丹参多酚酸治疗后7月龄APPswe/PS1dE9(APP/PS1)小鼠血浆和海马组织代谢组学的变化。方法:1通过改良葡萄糖过氧化氢酶(MUT.Q-GDH)法快速检测小鼠全血的葡萄糖含量。采用胆固醇氧化酶-过氧化物酶(CHO-POD)法检测血浆中总胆固醇的含量;运用磷酸甘油酯氧化酶-过氧化物酶(GPO-POD)法检测血浆中甘油三酯的水平;利用直接法检测血浆中高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的浓度。2用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠海马组织Aβ40和Aβ42的水平。3采用气相色谱-飞行时间质谱分析方法(GC-TOF-MS)检测各组小鼠海马组织代谢物质。结果:1与正常对照组相比较,APP/PS1模型组小鼠海马组织Aβ40和Aβ42明显升高(p<0.01)。丹参多酚酸的治疗显著降低了APP/PS1小鼠Aβ40和Aβ42的含量(p<0.01)。两种剂量的丹参多酚酸给药组之间,Aβ40和Aβ42的水平无明显差异(p>0.05)。另外,与正常组相比较,APP/PS1模型组小鼠海马Aβ42和Aβ40的比值升高(p<0.05),然而与APP/PS1模型组相比较,丹参多酚酸的治疗对APP/PS1小鼠海马组织Aβ42和Aβ40的比值无显著影响(p>0.05)。2四个实验组之间,小鼠全血葡萄糖和血浆甘油三酯的浓度在组间无明显差异(p>0.05)。高剂量丹参多酚酸的治疗降低APP/PS1小鼠血浆总胆固醇水平(p<0.05)。与正常对照组相比,APP/PS1模型组血浆低密度脂蛋白胆固醇水平增加(p<0.05)。丹参多酚酸的治疗显著降低了APP/PS1小鼠血浆中低密度脂蛋白胆固醇的含量(p<0.01)。APP/PS1小鼠血浆低密度脂蛋白胆固醇的水平与海马组织Aβ42水平呈正相关(p<0.01),相关系数(r)为0.875;血浆低密度脂蛋白胆固醇水平与海马Aβ40水平呈正相关(p<0.01),两者相关系数(r)为0.728。3四组小鼠海马组织共检测到357个色谱峰。经降噪处理后,海马内共有55个代谢产物被检出。经过丹参多酚酸的治疗,APP/PS1小鼠海马组织代谢产物的变化主要涉及两类代谢路径,碳水化合物代谢包括山梨糖醇,葡萄糖-6-磷酸,蔗糖-6-磷酸,半乳糖等物质,维生素代谢包括维生素d3和抗坏血酸。第三部分丹参多酚酸改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马组织的病理性损伤目的:研究经丹参多酚酸治疗后,APP/PS1小鼠海马组织淀粉样蛋白的表达,活化小胶质细胞的密度和与记忆相关的海马CA1区神经元及毛细血管内皮细胞超微结构的变化。方法:1采用HE染色和尼氏(nissl)染色进行各组小鼠海马的病理变化及神经元细胞数量的分析。2通过荧光刚果红染色和aβ免疫组织化学染色两种方法检测淀粉样斑块面积,并计算各组小鼠海马内淀粉样斑块的面积比。3运用免疫组织化学染色法检测小鼠海马部位离子钙接头蛋白1(Iba1)阳性细胞,分析单位面积内Iba1阳性细胞的数量。4通过透射电镜观察各组小鼠海马CA1区神经元和毛细血管内皮细胞超微结构的变化。结果:1丹参多酚酸的治疗逆转了APP/PS1小鼠海马组织内的空泡样变。2四个实验组海马CA1区每高倍视野神经元数量之间无明显差异(p>0.05)。3丹参多酚酸治疗14w后,APP/PS1小鼠海马组织荧光刚果红阳性淀粉样斑块面积比与相同层面模型组小鼠相比较,第一、二、五层均明显下降(p<0.01),第三、四层也有所降低(p<0.05)。4经30mg/kg及60mg/kg丹参多酚酸治疗后,aβ阳性淀粉样斑块面积比与相同层面APP/PS1小鼠斑块面积比相比较,第一、二和五层明显下降(p<0.01),第三、四层也略有降低[(layer3:60mg/kgTSA,p<0.05);(layer4:30mg/kgTSA,p<0.05;60mg/kgTSA,p<0.01)]。5APP/PS1模型组小鼠海马单位面积内Iba-1阳性细胞与正常对照组相比较显著增多(p<0.01)。经丹参多酚酸治疗后,海马单位面积内Iba-1阳性细胞明显下降(p<0.01),并且与正常对照组相比无明显差异(p>0.05)。6经丹参多酚酸的治疗,APP/PS1小鼠海马CA1区神经元线粒体结构和毛细血管内皮细胞超微结构改善。结论:丹参多酚酸的治疗可通过保护APP/PS1小鼠海马的组织结构,降低APP/PS1小鼠海马组织淀粉样蛋白的表达,降低炎细胞-小胶质细胞的密度,保护APP/PS1小鼠与记忆相关的海马CA1区神经元细胞,血管内皮细胞的超微结构,从而调节血浆及海马组织代谢物质,进而提高了APP/PS1小鼠的学习和记忆能力。从代谢组学和病理学等方面探究了丹参多酚酸的治疗对改善APP/PS1小鼠学习和记忆能力的机理,既往尚未有相关报道,具有一定的独创性。