本研究目的是寻找、定位与ESCC相关的扩增的癌基因以及缺失的抑癌基因，并探讨他们在ESCC发病过程中的作用及可能的机制。首先，我们采用CGH对ESCC进行全基因组扫描，锁定高频染色体扩增与缺失区段；进一步用FISH和免疫组化的方法在含大宗病例的组织芯片上，筛选和验证与ESCC有关的扩增的癌基因和缺失的抑癌基因。再结合临床病理资料，力图揭示ESCC的某些分子特征，为全面和深入认识ESCC分子细胞遗传学致癌机制，提供研究基础。 本文研究分为4部分： 一、比较基因组杂交技术检测食管鳞状细胞癌分子遗传学改变 收集31例新鲜ESCC组织，包括癌组织和癌旁正常食管粘膜组织。提取全基因组DNA，采用缺口平移法，分别标记以光谱绿dUTP和光谱红dUTP，制备成探针；与正常人的分裂中期染色体杂交；荧光显微镜下观察，CGH软件图像分析，判别出差异区带。再结合临床病理资料，进一步分析ESCC扩增及缺失与临床病理资料之间的联系。 二、ESCC染色体20q及3q高频扩增区癌基因的筛选与验证 收集了食管鳞状细胞癌患者手术切除标本221例，制作出包含364(156例)及325(65例)个样本的TMA蜡块2块；根据前面的CGH结果，选取染色体高频扩增区20q及3q所包含的几个BAC，对BACDNA标记以红色荧光，用绿色荧光标记不含基因的20p12区BAC或3号染色体着丝粒作对照，制备成探针；在含大宗ESCC病例的组织芯片上进行间期核双色FISH杂交，荧光显微镜下观察，图象分析，判别出探针在肿瘤组织中的扩增；并与临床病理资料以及Ki-67、P53、AR、ER、PR免疫组化结果分析它们之间的联系， 三、ESCC染色体3q与20q区候选癌基因EIF5A2和SRC-3的免疫组化检测 基于FISH检测发现20q12区的癌基因SRC-3与3q26区癌基因eIF-5A2的扩增参与了部分ESCC的发病过程，本实验在ESCC组织芯片上应用免疫组织化学方法，检测SRC-3、eIF-5A2编码的蛋白在ESCC中的表达情况以及它们与基因扩增之间的关系；并与临床病理资料以及Ki-67、P53、AR、ER、PR结合分析它们之间的联系，结果如下： 1.SRC-3表达：有94(46％)例肿瘤组织出现SRC-3蛋白的过度表达；而癌旁正常食管粘膜细胞和间质细胞SRC-3蛋白均呈正常表达。SRC-3蛋白在T3～4期的ESCC中过度表达率(66/123，54％)，远较T1～2期(28/80，35％，P=0.008，Chi-squaretest)高；差异有统计学意义。在94例SRC-3蛋白过度表达的病例中，Ki-67的平均阳性率为29.7％，明显高于102例SRC-3蛋白正常表达组(21.9％)；差异有统计学意义(P=0.004)。 SRC-3蛋白表达与它的基因扩增存在明显的相关性，P=0.0025。在绝大部分(13/15，87％)有SRC-3基因扩增的ESCC中，SRC-3蛋白呈过度表达，而在59％(59/100)SRC-3基因无扩增的ESCC中，SRC-3蛋白为正常水平表达。然而，SRC-3基因扩增与蛋白的表达不总是一致。 2.EIF5A2表达：有44(20.9％)例肿瘤组织出现蛋白的过度表达；而癌旁正常食管粘膜细胞和间质细胞EIF5A2蛋白均呈正常低表达。在有淋巴结转移的ESCC原发灶中EIF5A2蛋白过度表达率为(19/64，29.7％)，明显高于无淋巴结转移组(25/146，17.1％，P=0.035，Chi-squaretest)；差异有统计学意义。在43例伴随EIF5A2蛋白过度表达的ESCC中，Ki-67的平均阳性率为29.0％，明显高于158例EIF5A2蛋白正常表达组(20.9％)；差异有统计学意义(P=0.007)。 EIF5A2蛋白表达与基因扩增之间存在明显的相关性，P=0.000。在绝大部分(17/20，85％)有eIF-5A2基因扩增的ESCC中，都伴随有EIF5A2蛋白的过度表达。而在eIF-5A2基因无扩增的88％(99/112)ESCC中，EIF5A2蛋白表达均呈正常水平。然而，eIF-5A2基因扩增与蛋白的表达不总是一致。 四、ESCC染色体3p缺失区的候选抑癌基因FHIT、HYAL1、RASSF1A的免疫组化检测 根据CGH结果，选择了ESCC高频缺失区域3p21-3p11上的3个候选抑癌基因FHIT、HYAL1、RASFF1A，在含大宗病例的ESCC组织芯片上，用免疫组化技术检测这三个基因编码蛋白的表达情况，并与临床病理资料结合分析，研究ESCC发病与这些抑癌基因的关系，结果发现： 癌旁正常食管粘膜FHIT蛋白表达率(37/48，78.1％)远较在癌中(24/50，48.0％)高，差异有显著性(P=0.003)；说明FHIT蛋白在癌中表达明显下调。在210例ESCC中，97例(97/210，46.2％)肿瘤组织缺乏FHIT蛋白表达或表达下调；且肿瘤晚期(T3～4期)FHIT蛋白表达下调(64/124，51.6％)比T1～2期(33/86，38.4％)更频发；差异接近显著性(P=0.058)。 ESCC中的HYAL1蛋白阳性表达率(22/49，44.9％)似乎较癌旁(13/47，27.7％)高，但差异没有显著性(P=0.079)。在211例ESCC中，有97例(97/211，46.0％)肿瘤组织出现HYAL1蛋白阳性表达。但与临床病理资料无明显的相关性。 癌旁正常食管粘膜的RASSF1A蛋白阳性表达率(39/50，78.0％)远较癌中(23/49，46.9％)高；差异有显著性(P=0.0014)；说明RASSF1A蛋白在癌中表达明显下调。206例ESCC中，117例(117/206，56.8％)肿瘤组织缺乏RASSF1A蛋白表达或表达下调。肿瘤晚期(T3～4期)RASSF1A蛋白表达下调(83/131，63.4％)比T1～2期(45.3％，34/75)更频发；差异有显著性(P=0.012)。分化差的ESCC中RASSF1A蛋白表达下调比分化好更明显，差异有统计学意义(P=0.000)。 根据上述结果，我们得出如下结论： 1.染色体3q、8q、20q、5q、1q、12p的扩增以及3p、1p、4p、5q、8p、9p的缺失是华南地区ESCC发生与发展过程中的频发事件，提示染色体的这些区域可能存在与ESCC发生与发展相关的癌基因扩增与抑癌基因的缺失； 2.ESCC染色体20q区域存在癌基因SRC-3、ZNF217、STK15、EEF1A2的扩增，可能参与ESCC的发生与发展过程； 3.20q区域的4个扩增的癌基因SRC-3与ZNF217、STK15、EEF1A2，处于2个独立的扩增子上；ZNF217、STK15、EEF1A2存在共扩增的关系，并以STK15为核心或者核心靶基因； 4.SRC-3、eIF-5A2基因扩增促进了其编码蛋白的过度表达，为ESCC的发生和发展提供了选择性优势，参与了ESCC发展与演进的过程； 5.ESCC的3p高频缺失区有抑癌基因FHIT和RASSF1A基因缺失，可能参与ESCC的发病过程。