登革热(DengueFever,DF)是登革病毒(DengueVirus，DENV)感染引起的急性传染病，是世界上广泛传播的虫媒病毒性疾病之一。其主要传播媒介是埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)。控制媒介伊蚊是防治DF最有效的方法，然而传统上控制媒介的措施有许多局限导致防治效果下降，如抗药性增强，环境污染，成本太高等。以现代分子生物学为基础的转基因技术的出现为蚊媒疾病的防治提供了一个新的途径。转基因蚊虫研究的最重要的一步是研制出抗性因子。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)作为近年来研究的热门，已被广泛地应用到各个医学领域，包括基因功能研究，抗病毒治疗等。在蚊细胞内引入登革病毒的双链RNA能使蚊细胞对登革病毒在细胞内的增殖产生抗性，即细胞内免疫(intracellularimmunization)。构建能在蚊虫体内转录登革病毒的双链RNA的重组载体是其中关键的一步。 本研究根据登革Ⅱ型病毒NGC株prM基因的部分序列设计2对引物，第1对与第2对引物仅上游引物引入的酶切位点不同。以感染登革Ⅱ型病毒的白纹伊蚊C6/36细胞提取的总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增约400bp大小的prM基因片段。将PCR产物用T-A克隆的方法插入到pMD18-T载体，得到pMDa和pMDb重组质粒。通过双酶切鉴定和测序表明，所克隆的序列为登革Ⅱ型病毒prM基因序列。与登革病毒Ⅱ型NGC株相比，prM基因片段(去掉两端部分引物的序列)的同源性为99％，387个碱基中有两个碱基不同，分别是第132位A变为G，编码的氨基酸没有变，第166位T变为C，编码的氨基酸由F变为L。将pMDb以KpnⅠ和BamHⅠ双酶切得到的小片段插入到pMDa质粒上，得到具有prM基因正向序列和反向重复序列串联结构的重组质粒pMD-prm-irprm.再将prm-irprm串联结构以HindⅢ和SacⅠ双酶切，并亚克隆到昆虫表达载体pIEx-1上，构建成重组质粒pIE-prm-irprm.将pMDb以KpnⅠ和PstⅠ双酶切得到的小片段插入到pIEx-1上，构建重组质粒pIE-irpm作为对照质粒之一。双酶切鉴定和测序表明载体构建成功。在转染之前，所有转染用的质粒用QIAGEN的EndoFreePlasmidMaxiKit质粒抽提试剂盒抽提。将重组质粒和各对照质粒用脂质体Cellfectin转染白纹伊蚊C6/36细胞，再用登革Ⅱ型病毒和Ⅰ型病毒感染细胞，观察免疫效果。通过对照组质粒pIE-irprm的RT-PCR检测表明转染成功，且pIE-irprm能在C6/36细胞内转录。通过TCID50测定病毒的滴度，描绘滴度随时间的变化曲线，表明转染pIE-prm-irprm的细胞感染的登革病毒的滴度比对照组plE-irprm，pIEx-1和空细胞的低。 这些研究表明：以RT-PCR扩增目的片段，利用T载体及其限制酶切位点亚克隆构建转录登革病毒发夹状dsRNA的方法简单可行；IE1启动子及其上游的hr5增强子结构在C6/36细胞内有活性；转染pIE-prm-irprm的蚊细胞对登革Ⅱ型病毒产生一定的抗性。提示只要进一步筛选到更合适的登革病毒基因片段，选择更合适的载体，以本实验经验为基础，将为抗登革病毒转基因蚊虫的最终研制奠定良好的基础。