人工微小RNA (artificial microRNA)和合成反式作用小分子干扰RNAs (syn-tasiRNAs)在植物基因功能研究中已经得到了广泛应用。一个TAS基因可以同时产生多个tasiRNAs,因而TAS基因具有同时干扰多个靶基因的应用前景,然而,其干扰效果仍不尽人意。本研究通过对拟南芥TAS3a产生tasiRNAs的限制性因子进行分析,得到了优化的TAS3a基因,且其对靶基因的干扰效果明显,此结果在植物基因功能研究中具有一定的应用价值。基于我们建立的XVE诱导性多基因表达系统,分析了miR390, AGO7, DRB4和SGS3四个作用因子对TAS3a产生有效tasiRNA的影响。结果显示,与诱导表达AGO7, DRB4和SGS3相比,只有当诱导表达miR390a时,产生于TAS3a的沉默报告子syn-tasiRNA/PDS对靶基因PDS的干扰效果明显增强。另外,随着诱导时间的增加,成熟miR390的表达量逐渐增加,相应地,沉默报告子syn-tasiRNA/PDS的表达量逐渐增加,而靶基因PDS mRNA的表达量逐渐下降。这表明了miR390是TAS3a产生有效tasiRNAs的限制性因素。提高tasiRNAs的表达量及其生成的同步性(in-phase)是增强tasiRNAs有效性的两个重要因素。TAS3a基因产生tasiRNA的区域(两个miR390靶位点间)越长,其产生非同步性的无效tasiRNAs的几率越高,造成脱靶效应这样的负效应将越严重。为了减少非同步性tasiRNAs引起的脱靶效应,将TAS3a基因进行截短,获得截短型TAS3a基因。对其进行功能分析发现,与全长型TAS3a基因相比,截短型TAS3a基因可以更有效地干扰靶基因PDS的表达。基于以上研究,在截短型TAS3a基因的内含子中插入miR390a基因,得到优化的TAS3a基因-截短型TAS3a-miR390a两融合基因。对其进行功能分析发现,诱导表达截短型TAS3a-miR390a两融合基因和截短型TAS3a时,前者产生的沉默报告子syn-tasiR/PDS对靶基因PDS的干扰效果明显好于后者。另外,超表达TAS3a-miR390a两融合基因对TCP家族的多个成员也有较理想的干扰效果。这些研究结果表明,TAS3a-miR390a两融合基因作为优化的TAS3a基因可以更有效地干扰单个或多个目标基因的表达。TAS3a的两个miR390靶位点间的区域越短,特异性越好,但过短的TAS3a基因可能会影响syn-tasiRNA的产生。构建了一系列截短型TAS3a-miR390a两融合基因,对其产生有效tasiRNAs的最短间距进行分析,发现与野生型相比,当两个miR390靶位点间的区域最短截短到可以产生一个21nt tasiRNAs时,沉默报告子对靶基因PDS没有明显的干扰效果。当两个miR390靶位点间的区域最短截短到可以产生两个21nt tasiRNAs时,沉默报告子对靶基因PDS有明显的干扰效果。这表明TAS3a基因的两个miR390靶位点间的最短间距为能容纳两个21nt tasiRNAs的长度。为了产生更多有效的syn-tasiRNAs,尝试使用miR173靶点替代TAS3a的3’-miR390靶点,将miR390a基因和miR173基因融合并插入到TAS3a基因的内含子中,得到：TAS3a, TAS1c, miR390a和miR173四基因融合体。在四基因融合体中,TAS3a和TAS1c的syn-tasiRNAs产生区域分别位于miR390靶点与miR173靶点间和miR173靶点后面。对其进行功能验证,结果显示位于miR173靶点后面的沉默报告子对靶基因有强的干扰效果,表明TAS3a和TAS1c融合后可以按照各自的机制产生有效的syn-tasiRNAs,并且四基因融合体可用于同时干扰多个基因的表达。同时,也验证了TAS3a产生有效tasiRNAs的最短间距是两个21nt tasiRNA的长度。总之,通过对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响因素进行分析,发现miR390是其限制性因素,TAS3a产生有效syn-tasiRNA的区域长度至少能够容纳2个syn-tasiRNAs。在此基础上得到了优化的TAS3a基因,包括TAS3a-miR390a两融合基因和TAS3a-TAS1c-miR390a-miR173四基因融合体,可以为影响植物生长发育,种子萌发,以及致死的基因的功能研究提供干扰手段。