背景脑卒中是一种常见的由脑出血或缺血导致局部神经功能损伤的神经系统疾病,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。近年来,对脑缺血内胶质细胞参与的免疫应答及炎症反应的研究日益增加。小胶质细胞是大脑中的“巨噬细胞”,其活化对于调节脑缺血后神经元凋亡、促进神经发生和功能恢复至关重要。CSF1R全称为集落刺激因子1受体,是一种跨膜络氨酸激酶,主要负责调控小胶质细胞增殖和分化。研究发现Ko20227是CSF1R的特异性抑制剂可跨越血脑屏障,抑制CSF1R磷酸化来调节小胶质细胞的活性和数目。在全脑缺血模型中,Ki20227调节脑缺血后小胶质细胞的形态和密度,进而调节神经元突触可塑性。其次,小胶质细胞数目的改变或M1/M2表型转变可能参与调节脑缺血病灶处的炎症反应。雷公藤甲素(Triptolide,TP)是典型的抗炎药物,提炼于中药雷公藤的根部,用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病,也是调节自噬和氧化应激的重要因子,在很多中枢系统疾病中起神经保护作用。在脑缺血小鼠中,TP调节脑内小胶质细胞的活化状态从而实现对NLRP3小体炎症的抑制作用。前期研究结果表明TP可以显著降低脑缺血模型大鼠的脑梗死面积,降低半影区NF-κB介导的炎症反应,调节自噬水平。自噬在缺血性脑卒中等中枢神经系统疾病的神经炎症反应中起重要作用,而小胶质细胞自噬主要负责调节大脑中细胞因子。最近的研究显示小胶质细胞自噬对小鼠神经突触发育以及社交行为调节具有重要作用。抑制小胶质细胞自噬会使突触小体降解受损,改变不同脑区之间的联系。因此,消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬为研究脑缺血中小胶质细胞的功能提供有力工具。以小胶质细胞介导的炎症的反应为切入点,明确TP在脑缺血中起神经保护作用的具体机制,对阐明脑缺血的病理机制和药物靶点研究有重要意义和影响。目的1.探究消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬对脑缺血小鼠大脑皮层小胶质细胞和神经元的影响。2.探究TP对消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬小鼠脑缺血后大脑皮层小胶质细胞和神经元的影响以及可能调节机制。方法1.双光子活体成像检测CX3CR1-GFP小鼠在Ki20227给药不同时间内大脑皮层小胶质细胞数目变化。2.利用玫瑰红光化学诱导法构建局灶性脑缺血模型。3.TTC染色方法检测局灶性脑缺血模型的建立是否成功。4.基于Cre-loxp系统,利用CX3CR1-Cre和ATG5flox/flox小鼠构建小胶质细胞自噬缺陷小鼠。5.电生理技术检测正常小鼠和CX3CR1+/-ATG5flox/flox小鼠在脑缺血前后大脑皮层半阴影区锥体神经元兴奋性变化。6.疲劳转棒实验、体重变化、神经行为评分和旷场实验检测造模前后各组小鼠行为学的变化。7.免疫荧光和免疫印迹方法检测造模前后各组小鼠大脑皮层损伤部位小胶质细胞和神经元相关蛋白的表达变化。8.荧光定量PCR方法检测造模前后各组小鼠大脑皮层损伤部位小胶质细胞炎症相关和神经元突触相关因子的mRNA表达变化。结果第一部分1.双光子活体成像和Iba1免疫荧光结果显示,随着给药时间的延长,小胶质细胞数目逐渐减少。和对照组相比,给药7天时,小胶质细胞数目减少约13.7%。2.TTC染色结果显示注射玫瑰红(10mg/mL)5分钟后,6000kcal的冷光源照射15分钟造成约15%的大脑皮层梗死。此结果显示成功建立了玫瑰红光化学诱导局灶性脑缺血小鼠模型。3.行为学检测显示单纯Ki20227药物处理对正常小鼠的平衡能力,体重以及神经行为评分没有影响。缺血后,Ki20227给药组小鼠在转棒上的停留时间有显著性降低,神经行为评分增加,体重无显著性变化。TP增加Ki20227给药脑缺血小鼠在转棒上的停留时间,降低其行为学评分,促进小鼠行动能力的恢复。4.脑缺血引起各组小鼠大脑皮层半阴影区小胶质细胞数目显著增加,小胶质细胞炎症因子(TNF-α,IL-10,IL-6)和表面受体(CD86,Arg-1,CXCL1,CCL-1)的表达显著增加。TP预处理促进Ki20227给药组小鼠脑缺血后大脑皮层半阴影区小胶质细胞数目减少和TNF-α,IL-6等炎症因子的表达降低。5.单纯Ki20227给药处理可抑制NF-κB的蛋白表达。脑缺血后,对照组和Ki20227给药组NLRP3炎症小体相关蛋白表达增加,NF-κB的蛋白表达增高。TP预处理降低NF-κB的表达,降低NLRP3炎症小体相关蛋白表达。6.单纯Ki20227给药处理对神经元数目,神经元树突棘密度和突触蛋白PSD95,SYN的表达无影响。缺血后,神经元数目显著减少,树突棘密度降低,突触蛋白PSD95,SYN的表达降低;而TP预处理能够增加Ki20227给药缺血小鼠大脑皮层神经元数目,促进神经元树突棘密度和突触蛋白PSD95,SYN的表达增加。7.缺血后,Ki20227给药组小鼠大脑皮层损伤部位自噬相关蛋白LC3Ⅱ,ATG5表达增加,P62,Beclin1表达降低;而BDNF,AKT和p-ERK蛋白表达显著减弱;TP预处理抑制Ki20227给药小鼠大脑皮层损伤区域LC3Ⅱ,ATG5表达,促进P62,Beclin1,BDNF,AKT 和 p-ERK 表达的增加。第二部分1.成功构建小胶质细胞自噬缺陷小鼠。敲除小胶质细胞atg5基因显著抑制小胶质细胞自噬,但对小鼠的运动能力没有影响。2.脑缺血后,小胶质细胞自噬缺陷小鼠在疲劳转棒上停留的时间显著降低,行为学评分显著增高。TP能增加小胶质细胞自噬缺陷脑缺血小鼠在疲劳转棒上的停留时间,降低行为学评分,对体重变化无影响。3.抑制小胶质细胞自噬对小鼠大脑皮层小胶质细胞数目无影响,但小胶质细胞相关因子TNF-α等的炎症因子mRNA的表达显著增加。TP显著降低脑缺血小鼠半阴影区小胶质细胞的数量和炎症相关因子TNF-α,IL-10等的表达。4.抑制小胶质细胞自噬降低小鼠大脑皮层神经元数目,神经元树突棘密度,突触相关蛋白PSD95,SYN的表达。脑缺血后,各组的神经元指标显著降低。TP预处理减轻脑缺血后大脑皮层神经元数量和树突棘密度的减少以及树突相关蛋白的丢失。5.抑制小胶质细胞自噬促进大脑皮层锥体神经元发放动作电位。而脑缺血后,椎体神经元发放动作电位减少。但TP预处理促进了缺血后大脑皮层锥体神经元动作电位发放个数。6.小胶质细胞自噬缺陷小鼠大脑皮层NLRP3,NF-κB和Caspase1蛋白表达量增加;脑缺血加重损伤部位NLRP3,NF-κB和Caspase1的蛋白表达增加。而TP显著降低NF-κB、NLRP3的表达和Caspase1活化。7.脑缺血后,小胶质细胞自噬缺陷小鼠损伤部位BDNF蛋白表达降低,LC3Ⅱ蛋白表达进一步增加。TP增加BDNF,AKT,p-ERK蛋白的表达,降低LC3Ⅱ,P62等自噬相关蛋白的表达。结论消除小胶质细胞降低脑缺血后TNF-α和NF-κB等炎症因子的表达实现对神经元的保护作用;抑制小胶质细胞自噬会促进脑缺血后小胶质细胞炎症相关因子和NLRP3炎症小体的表达,抑制BDNF-AKT通路,损坏神经元树突棘密度以及突触蛋白。TP预处理促进小胶质细胞数目缺失或自噬抑制小鼠脑缺血后大脑皮层小胶质细胞数目减少,降低相关炎症因子的表达,进而抑制NLRP3炎症小体和整体自噬水平,激活BDNF-AKT信号通路,从而增加树突棘密度,突触蛋白的表达和神经元数目,最终促进神经行为功能的恢复。