论文部分内容阅读
禽流感是危害养禽业的主要疫病，尤其是H9亚型低致病性禽流感病毒。由于该病毒感染一般不会造成禽类的大量死亡，只引起比较轻微的呼吸道症状，跟禽类其它的呼吸道疾病极为相似，因此具有极大的隐蔽性和欺骗性，更容易在鸡群中蔓延。鉴于此，建立H9亚型低致病性禽流感的诊断方法就显得格外重要。目前，禽流感的主要诊断方法为病毒分离、血凝及血凝抑制试验、RT-PCR等，这些方法耗时长、操作复杂，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，该方法仅需一个简单的恒温装置，在几十分钟内就能够完成核酸扩增反应。其最重要的特点就是扩增效率极高，反应时间也较短，且可以靠直接观察扩增产物产生的沉淀来观察扩增的结果。与传统的PCR方法相比LAMP方法不需要复杂的温度变化，长时间的温度循环，以及琼脂糖凝胶电泳紫外观察等复杂过程，LAMP检测方法很适合进行基层部门的快速检测。本研究建立了H9亚型禽流感病毒的LAMP检测方法并进行了初步应用，主要内容包括：1.本研究参考禽流感病毒的基质蛋白(M)基因设计了两对引物，可以特异性识别其6个不同位点，初步建立了LAMP检测方法，并对其敏感性、特异性和重复性进行了测定。结果发现该方法特异性很强、敏感性高，只能检出H9亚型禽流感病毒的核酸，而对其他禽源病毒的检测结果均为阴性；该方法对禽流感病毒的检测极限为100fg，可用于临床样品的检测。2.选取了三株H9亚型禽流感病毒(DJ-1200, CJ-1301, D2-415)进行SPF鸡攻毒试验，采集泄殖腔棉拭子分析其排毒情况，确定D2-415毒株用于排毒规律研究。结果发现，D2-415毒株在攻毒后36h时开始出现排毒，攻毒后84h为排毒高峰，攻毒后108h几乎所有的鸡均出现排毒情况。同居感染的SPF鸡也出现了排毒情况，排毒时间与攻毒组的排毒高峰期几乎完全重合。对建立的LAMP方法与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较分析，结果表明三种方法符合率较高，均可用于排毒规律的研究，其中LAMP方法与病毒分离的符合率为96.7%，LAMP方法与RT-PCR方法的符合率为98.3%。本研究建立的LAMP方法特异、敏感、简便，在禽流感的诊断过程中具有很大的临床应用潜力。