1.发酵豆粕替代鱼粉和豆粕对日本鳗鲡黑仔鳗生长、血清和肝脏的抗氧化能力以及生化指标的影响为研究日本鳗鲡(Anguilla japonica)黑仔鳗饲料中发酵豆粕对鱼粉的替代效果及豆粕的可能作用,设置5组实用饲料,以含有60%鱼粉和5%豆粕的A组为对照组,分别使用10%(B组)和20%(C组)的发酵豆粕替代对照组中11.7%和23.3%的鱼粉,并在此基础上分别用4.5%的发酵豆粕替代B组和C组中全部的豆粕设置成D组和E组。在水泥池的网箱中饲养初始体质量为(0.405±0.003)g的日本鳗鲡黑仔鳗76d。结果显示:随着发酵豆粕使用量的增加,特定生长率、增重率和存活率逐渐升高;B组特定生长率、增重率和存活率显著高于D组,C组特定生长率、增重率和存活率高于E组但差异不显著。试验组血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性以及丙二醛(MDA)含量均低于对照组,总抗氧化能力(T-AOC)活性除D组外均显著高于对照组;B组MDA含量显著低于D组。随着发酵豆粕使用量的增加,肝脏中的T-AOC、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、和过氧化氢酶(CAT)活性呈现逐渐上升的趋势,MDA含量则相反,ALT、AST活性呈先增加后下降的趋势。血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量随发酵豆粕用量增加而增加;在鱼粉用量相同时,含有5%豆粕比不含豆粕的试验组有更高的血清TP以及GLB含量。以上结果表明:饲料中用发酵豆粕替代鱼粉可以提高日本鳗鲡黑仔鳗的生长性能、血清和肝脏抗氧化能力及肝功能;豆粕在不同发酵豆粕使用量下对日本鳗鲡黑仔鳗的生长影响效果不同:在低水平发酵豆粕使用量下,豆粕的使用会促进其生长性能,但在高水平发酵豆粕使用量下则无此现象。2.发酵豆粕替代鱼粉和豆粕对日本鳗鲡黑仔鳗肌肉常规成分、氨基酸以及脂肪酸组成的影响为了研究发酵豆粕替代鱼粉对日本鳗鲡黑仔鳗肌肉常规成分、氨基酸以及脂肪酸组成的影响以及豆粕在其中发挥的可能作用,基于第一章养殖实验的设计,采集5个试验组的日本鳗鲡黑仔鳗肌肉样本并测定其粗蛋白、粗脂肪、水分、粗灰分、氨基酸以及脂肪酸等指标。测定结果显示:1、共测得17种氨基酸,必需氨基酸7种,半必需氨基酸2种,非必需氨基酸8种;共测得23种脂肪酸,其中饱和脂肪酸6种,单不饱和脂肪酸8种,多不饱和脂肪酸9种。2、在A、B、C三组,随着发酵豆粕使用量的增加,日本鳗鲡黑仔鳗肌肉粗蛋白含量呈现先减少后增加的趋势,粗脂肪则相反;氨基酸含量∑EAA、∑NEAA以及∑EAA/∑NEAA等指标均出现一定程度的升高;∑HEAA、∑FAA与对照组相比并无显著性差异;14种脂肪酸含量呈现上升后下降的趋势,ΣSFA、ΣMUFA、ΣPUFA、∑n-3PUFA等指标亦是如此。3、在B、D两组间,豆粕的缺失,造成日本鳗鲡黑仔鳗肌肉粗蛋白含量增加,粗脂肪含量下降;14种氨基酸含量呈现上升,3种氨基酸含量在两组间无显著差异;19种脂肪酸含量以及ΣPUFA、ΣMUFA、∑n-3PUFA、∑n-6PUFA、ΣSFA、脂肪酸总量等6类指标呈现下降。4、在C、E两组间,豆粕的缺失,造成日本鳗鲡黑仔鳗肌肉粗蛋白含量出现下降,粗脂肪含量出现上升;14种氨基酸含量出现下降,3种氨基酸含量在两组间无显著差异;同C组相比,E组的蛋氨酸呈现上升(P<0.05);4种脂肪酸含量呈现上升,2种脂肪酸含量呈现下降。综上所述,发酵豆粕的用量显著影响日本鳗鲡黑仔鳗肌肉粗蛋白、粗脂肪、氨基酸以及脂肪酸的含量。在不同发酵豆粕使用量下,豆粕对日本鳗鲡黑仔鳗肌肉粗蛋白、粗脂肪、氨基酸以及脂肪酸的含量的影响是不同的:在低水平发酵豆粕使用量下,豆粕更有利于提高其脂肪酸含量,在高水平发酵豆粕使用量下,豆粕更有利于提高其氨基酸含量。3.发酵豆粕替代鱼粉和豆粕后日本鳗鲡黑仔鳗肠道微生物的结构变化基于对日本鳗鲡黑仔鳗的第一章中生长指标的结果,为更为深入的研究发酵豆粕替代鱼粉后以及豆粕对日本鳗鲡黑仔鳗肠道微生物群落的影响,在无菌条件下采集5个试验组的肠道样本,并对其进行高通量测序。结果显示:1、10%的发酵豆粕可以促进日本鳗鲡黑仔鳗的肠道菌群多样性和菌群丰富度;在发酵豆粕使用量较低的饲料中,搭配使用少量豆粕,可以提高日本鳗鲡黑仔鳗肠道菌群的多样性;在发酵豆粕使用量较高的饲料中,搭配使用少量豆粕则没有效果。2、饲料中使用一定的发酵豆粕和豆粕有利于改善日本鳗鲡肠道微生物结构,降低致病菌群的丰度。3、通过预测分析发现,发酵豆粕的使用没有降低日本鳗鲡的肠道微生物对于氨基酸、脂类以及碳水化物的代谢功能,豆粕亦是如此。以上结果表明:饲料中使用一定的发酵豆粕和豆粕,有益于改善日本鳗鲡黑仔鳗微生物群落的多样性和结构。4.发酵豆粕替代鱼粉和豆粕对日本鳗鲡黑仔鳗肝脏代谢的影响代谢组学专门研究生物体关于外界环境改变所引起对其代谢产物的影响,是与表型联系最紧密的系统生物学研究方法。基于第一章中的生长结果,为了更为深入的研究发酵豆粕替代鱼粉和豆粕后,日本鳗鲡黑仔鳗肠道肝脏代谢与机体生长性能之间的关系,对5个试验组的日本鳗鲡黑仔鳗肝脏进行了代谢组学分析。结果显示:1、在A、B、C三组间,随着发酵豆粕使用量的增加,共检测到31种差异代谢物。其中日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中琥珀酸酯、柠檬酸盐、苹果酸等代谢物出现下调,顺势乌头酸等代谢物出现上调。将差异代谢物映射到KEGG通路发现,发酵豆粕显著影响了日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中的二羧酸代谢、三羧酸循环等代谢途径。2、在B、D两组间,共检测到29种差异代谢物。豆粕的缺失显著影响了腐胺、N-乙酰腐胺等毒性代谢物的上调。将差异代谢物映射到KEGG通路中发现,饲料中豆粕的缺失,会显著影响日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中的精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢以及嘌呤代谢等代谢途径。3、在C、E两组间,共检测到67种差异代谢物。豆粕的缺失显著影响了原儿茶酸脂、奎宁酸盐、L-去甲肾上腺素、富马酸盐、乙醇酸盐等代谢物的下调。将差异代谢物映射到KEGG通路中发现,饲料中豆粕的缺失,会显著影响日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中的三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢、二羧酸代谢等7条代谢途径。综上所述,结合第一章的生长结果,发酵豆粕的使用可能从提高了三羧酸循环和二羧酸这两条代谢途径提高了日本鳗鲡黑仔鳗体内代谢水平,从而促进其生长。在低水平发酵豆粕使用量下,饲料中搭配豆粕可能通过提高日本鳗鲡黑仔鳗对于甘氨酸代谢水平从而促进了其生长。在高水平发酵豆粕使用量下,饲料中存在豆粕与否虽未显著影响日本鳗鲡黑仔鳗的生长,但显著改变了日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中多种代谢物的含量及代谢途径。5.发酵豆粕替代鱼粉和豆粕影响日本鳗鲡黑仔鳗肝脏代谢的转录分子机制DNA的转录会随着生长环境、摄食种类以及各种因素的变化而产生变化。基于日本鳗鲡黑仔鳗代谢组学的结果(第四章),为了进一步探究发酵豆粕替代鱼粉及豆粕后日本鳗鲡黑仔鳗肝脏代谢的转录分子机理,对5个试验组的日本鳗鲡黑仔鳗的肝脏进行了转录组学分析。结果显示:1、在A、B、C三组间,随着发酵豆粕的使用量的增加,日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中参与二羧酸代谢、三羧酸代谢,调控苹果酸脱氢酶的基因MSTRG.1873.3出现显著上调,直接造成下游代谢物苹果酸的下调。2、在B、D两组间,豆粕的缺失,使得日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中参与腺嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢等代谢途径,调控腺苷脱氨酶的基因MSTRG.14624.4出现下调,调控精胺合酶的基因MSTRG.9984.5、调控胍丁胺酶的基因MSTRG.8362.2出现上调,并间接导致了腐胺的上调。3、在C、E两组间,豆粕的缺失,使得日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中调控磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因MSTRG.17176.1、调控2-氧戊二酸脱氢酶E1的基因MSTRG.28724.1以及调控鸟氨酸-氧-酸转氨酶的基因MSTRG.26450.4等一系列调控酶类表达的相关基因发生显著变化。综上所述,发酵豆粕的使用显著改变了日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中调控参与二羧酸代谢以及三羧酸代谢中重要酶类的基因的转录水平,引起关键代谢物含量的变化,从而提高其代谢途径的效率,促进了其生长。在低水平发酵豆粕使用量下,豆粕的缺失造成日本鳗鲡黑仔鳗肝脏中调控参与腺嘌呤代谢以及谷胱甘肽代谢中重要酶类的基因的转录水平,引起关键代谢物含量的变化,从而降低其代谢途径的效率,对其生长造成负面影响。在高水平发酵豆粕使用量下,豆粕的缺失虽未对其生长造成显著影响,但也同样改变了日本鳗鲡黑仔鳗肝脏多种基因的转录水平及其调控酶所参与的代谢途径效率。