论文部分内容阅读
目的:慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)是各种病因引起的肾脏进行性的损伤和肾功能的逐渐恶化,严重威胁着病人的生命。慢性肾衰竭肾脏病理表现为肾脏纤维化。肾脏纤维化是指肾脏对慢性损伤的病理修复过程,包括肾间质纤维化与肾小球硬化。大量研究已证实,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积是肾小球硬化的主要病理特征。[1]ECM合成和降解的失衡是导致ECM过度沉积及肾小球功能损伤的主要原因。[1、2]细胞外基质(ECM)积聚主要由Ⅳ型胶原构成。国内外大量研究结果表明Ⅳ型胶原在肾小球内的过度堆积是肾小球硬化的特征性病理改变。[3、4]因此,Ⅳ型胶原已被广泛作为肾小球硬化的指标。对于ECM过度积聚,人们一直关注ECM合成的增加,近年来大量实验结果发现ECM降解酶系统异常在此过程中同样发挥重要作用。参与肾脏ECM降解的酶类主要有:丝氨酸蛋白酶系统(纤溶酶原激活物-纤溶酶系统)和基质金属蛋白酶系统(matrix metalloproteinases,MMPs)。大量研究结果已经证实:MMPs家族是降解ECM的主要酶体系,MMPs具有锌离子依赖性,其活化被认为是ECM降解的限速环节[5]。现已证实肾小球系膜细胞、毛细血管内皮细胞、脏层及壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞、浸润的单核巨噬细胞和中性粒细胞等均能不同程度地表达MMP-1、2、3、7、9、10及11。MMP-9作为人体内最重要的MMPs之一,它的主要功能是降解ECM的主要成分-Ⅳ型胶原[6]。MMPs的抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)能够特异性地封闭MMPs活性。目前已发现4种TIMPs(TIMP-1、2、3、4),其中对TIMP-1、2研究较多。TIMP-1可与MMP-9以1:1比例不可逆结合,特异性的阻断MMP-9的活性,在ECM积聚和降解的生理平衡中发挥重要作用。所以MMP-9表达减弱,TIMP-1表达增强,上述ECM降解效应减弱,即能促进肾小球硬化发生。已有许多学者在多种肾脏病中观察到TIMP-1表达增强[6-9]。肝再生增生强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya等[10]首次从初断乳大鼠肝脏中纯化并克隆出的一种具有热稳定性的非特异性促进肝脏细胞再生的因子。近年来国内外对ALR的研究多集中在肝脏,它可以促进肝脏再生[11]、抗肝纤维化[12、13]、抑制NK细胞活性、刺激肝癌细胞增殖等。但其mRNA在肝脏、肾脏、胸腺、睾丸等组织中均有表达,充分说明了ALR具有生物功能多样性。王爱民等[14]通过观察hALR对肝星状细胞基质分解素(MMP-3)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)基因表达的影响,从ECM降解代谢方面探讨hALR抗肝纤维化的作用机制。结果表明hALR可以促进肝星状细胞MMP-3的基因表达,从而促进ECM的降解,发挥其抗肝纤维化作用。同时,ALR可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP-1在肝组织中的表达。据国内文献报道,ALR在肾脏疾病方面的研究包括在急性肾衰竭、肾炎模型、庆大霉素损伤后的肾小管上皮细胞中的影响。已证实ALR直接或间接参与肾炎病理过程及急性肾小管损伤时刺激小管上皮细胞DNA合成等过程[15]。但目前国内外尚缺乏ALR与慢性肾衰竭的相关报道,鉴于ALR在肝脏纤维化中可以通过金属蛋白酶系统阻止肝脏纤维化的发生与进展,而金属蛋白酶系统在肾脏纤维化中有重要作用。探讨rhALR可否通过影响TIMP-1,MMP-9从而导致Ⅳ型胶原的产生发生变化,进而延缓肾小球硬化,为慢性肾衰竭的防治新方法提供理论依据。本课题拟通过重组人肝再生增强因子(rhALR)对5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭模型进行干预治疗,了解rhALR是否可以通过影响基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)及Ⅳ型胶原的表达部位和量,来延缓肾小球硬化。方法:将60只健康雄性SD大鼠随机分成假手术组(S组,n=20),对照组(C组,n=20),干预组(rhALR组,n=20)。C组及rhALR组大鼠行5/6肾切除,术后12周慢性肾衰竭大鼠模型制造成功,以rhALR作为干预药物对rhALR组进行干预(200μg/kg/d),用药1周。血生化检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值。石蜡切片行HE和Masson氏染色观察肾小球病理改变,免疫组化测定Ⅳ型胶原,MMP-9、TIMP-1的表达,Western-blot测定MMP-9,TIMP-1的表达。结果用均数±标准差(±s)表示,组间差异性比较采用单因素方差分析和q检验,显著性水平等于0.05,应用SPSS13.0软件包对所有数据进行统计学处理。结果:血生化检测结果提示:手术组血清Scr、BUN与假手术组(S组)相比,明显升高(P<0.05)。干预组(rhALR组)与对照组(C组)相比,血清Scr、BUN有显著性差异(P<0.05),毒素水平下降。肾脏病理学结果显示:HE染色及Masson氏染色光镜下可见C组肾小球有不同程度代偿性肥大,系膜细胞及基质增生,毛细血管塌陷,球囊粘连,可见局灶节段性硬化的肾小球。肾小管肿胀、颗粒变性、偶见灶状萎缩,肾间质增宽,间质可见炎细胞浸润,间质纤维细胞增生明显。与rhALR组及S组相比肾小球硬化指数差别有统计学意义,P值<0.05。免疫组织化学结果显示:在S组,Ⅳ型胶原在肾小球基底膜有少量表达,MMP-9主要表达于肾小管上皮细胞,少量表达于肾小球系膜细胞,TIMP-1与MMP-9表达位置接近,只是量较少。在C组,可以明显的看到Ⅳ型胶原沿肾小球基底膜深棕黄色强表达,较S组表达增多,MMP-9表达明显少于S组,TIMP-1表达较S组增多。rhALR组各指标表达介于S与C组之间,经软件分析单位面积阳性染色区域平均积分光密度(MOD),rhALR组、C组与S组之间,rhALR组与C组之间统计学处理后差异有显著性意义(P<0.05)。Western blot结果显示:于S组相比,rhALR组与C组Ⅳ型胶原、TIMP-1蛋白的表达水平较高,差别有显著意义(P<0.05),C组Ⅳ型胶原、TIMP-1的蛋白表达水平较rhALR组高,同样有显著性意义(P<0.05)。与rhALR组、C组相比,MMP-9在S组表达量最多,差异有显著性意义(P<0.05)。在rhALR组与C组之间,MMP-9表达在rhALR组相对较高,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:rhALR可以通过上调MMP-9,下调TIMP-1,减少Ⅳ型胶原积聚而改善肾小球硬化,为临床治疗慢性肾衰竭开拓新的思路,为了解rhALR的功能提供新线索。深入开发有良好的应用前景,其临床应用具有重要的现实意义。