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烯醇还原酶是一类可以利用NAD（P）H对α,β-不饱和C=C双键进行反式加氢的氧化还原酶,其在加氢的同时可以引进一个或两个手性中心,因此通过烯醇还原酶不对称还原烯烃化合物可以用于合成手性化合物。烯醇还原酶在生物界分布广泛,尤其是酵母和细菌。本论文以土壤为菌源筛选出一株具有不对称还原能力的菌株——蜡样芽孢杆菌WZY004,并从该菌中克隆表达出烯醇还原酶基因,进而研究了其酶学性质及催化性质,结果如下:1.以氧代异佛尔酮为目标底物,对土壤中能够不对称还原氧代异佛尔酮C=C双键的菌株进行了广泛筛选,综合考虑活性和立体选择性选取WZY004作为目标菌株进行研究。通过镜检、生理生化鉴定及16rDNA的鉴定确定该菌株属于蜡样芽孢杆菌并将其命名为蜡样芽孢杆菌WZY004。后续研究发现添加辅底物葡萄糖可以有效提高底物得率和产物e.e.值,当葡萄糖浓度是底物的5倍时得率和e.e.值分别为78.2%和84.4%。转速的提高同样可以提高转化率但同时会影响WZY004的立体选择性。底物特异性研究发现WZY004对反式-2-己烯醛和反式肉桂醛有良好的位点选择性,对反式-2-己烯醛的转化率和得率为97.2%和86.6%,对反式肉桂醛的转化率和得率为95.6%和87.6%;此外WZY004对柠檬醛和2-甲基-2-戊烯醛有的很高的立体选择性,产物e.e.值和得率分别为>99.0%和95.0%。2.从WZY004中找出并扩增出烯醇还原酶基因,连接至pEASY-E1载体上并在E.coli BL21（DE3）中实现重组表达,对表达后的重组酶进行分离纯化并进行了酶学性质研究。酶学性质发现该酶属于FAD依赖型黄素蛋白,其对氧代异佛尔酮的Km值和Vmax分别为1.83mM与1.13U/mg,并且能够同时利用NADH和NADPH,以NADH为辅底物时比酶活是NADPH的1.5倍。该酶不对称还原的最适pH和最适温度分别为7.5与60℃,但温度高于50℃时酶不稳定。底物特异性研究发现该酶对4-号位没有碳氧双键的氧代异佛尔酮的结构类似物（如异佛尔酮,4-羟基异佛尔酮,3-甲基环己烯酮）没有活力,推测氧代异佛尔酮4号位的碳氧双键对酶活力有重要作用。此外,该酶对多种直链烯烃均有活力,其中对2-甲基-2-癸烯醛和柠檬醛的相对活力分别高达144%和195%。3.建立了两种手性烷烃化合物的酶法不对称合成催化体系,反应以来自枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶构建辅酶循环,实现了辅酶的高效利用。对氧代异佛尔酮的还原体系如下:100mM Tris-HCl（pH8.5）缓冲液,0.5U/ml重组酶,100mM底物,400μM NADH,5.0U/ml GDH以及500mM葡萄糖。反应24h后产物（R）-左旋二酮的得率和e.e.值达到了85%和64%。对柠檬醛的还原体系如下:50mM Tris-HCl（pH8.5）缓冲液,1.0U/ml重组酶,10mM底物,400μM NADH,1.2U/ml GDH以及100mM葡萄糖。反应2h后产物（S）-香茅醛的得率和e.e.值达到了25%和>99%。在对柠檬醛的催化过程中发现该酶更倾向于催化（Z）-柠檬醛而对（E）-柠檬醛反应较弱。