慢性心力衰竭(CHF,chronic heart failure)是一组复杂的临床综合征,是各种病因导致心血管疾病的严重阶段。随着人口老龄化和医疗救治技术提高,心力衰竭患病率逐年增加,正在成为我国21世纪的重要公共卫生问题。慢性心力衰竭是一种进展性疾病,一旦发生即使去除病因,仍可通过心室重构不断发展。虽然近十余年来心衰的治疗策略得到明显改进,但其预后仍然很差,5年病死率仍与恶性肿瘤相仿。因此研究心力衰竭的发病机制,探索新的治疗靶点,成为心力衰竭的主要研究方向。心力衰竭的心肌代谢重构是近年来的研究热点之一。所谓代谢重构(metabolic remodeling)是指心力衰竭时,心肌细胞底物利用以及能量代谢紊乱的现象。研究表明在心衰发生发展的过程中,衰竭的心肌往往发生了能量代谢和底物利用的改变。这些代谢改变反映出衰竭心肌对能量需求增加,以及ATP合成利用能力受到了损害。大量临床与实验证据表明底物利用障碍和能量物质缺乏可能是导致心肌重构和慢性心衰进展的重要原因,对心衰心脏进行代谢干预可改善心脏功能。然而如何检测心肌能量代谢是心力衰竭代谢治疗需要面临的关键问题。现有的检测心肌代谢的方法主要是PET、MRI等影像学方法,但是这些方法操作复杂、设备昂贵,难以在临床推广应用。我们已经在前期的研究中建立了超声心动图评价心肌能量消耗(MEE)的方法。本研究中我们拟通过代谢组学技术检测心衰患者的血清代谢谱,分析其与超声心肌能耗指标MEE相关性,探讨血清代谢组学方法评价心衰心肌代谢重构的可行性。并在此基础上筛选能够客观、准确反映心肌能量代谢的血清生物标志物,从而建立一种实用、简便、经济、有效的评价心脏能量代谢的血清学方法。并希望通过这样一些标志代谢物,探讨心衰能量代谢障碍的发生机制,为发现新的心衰治疗靶点提供线索。本研究共分三个部分：第一章基于1H-NMR代谢组学方法在慢性心力衰竭中的应用代谢是生命活动的本质和物质基础,任何生命运动均离不开代谢。当机体受到外源性因素(如药物、毒物等)或内源性因素(代谢障碍、病理生理改变)影响时,在细胞、组织,甚至整体水平会发生代谢的变化应答,导致体液代谢物种类和浓度的变化。代谢组学通过检测代谢物水平的整体和动态变化,建立适当的分类模型,提取相关的生物代谢标志物簇(biomarker clusters),帮助明确诊断及了解疾病发病过程。我们在本章中利用代谢组学方法,通过研究代谢物图谱随时间的变化,分析心力衰竭过程中整体功能的完整信息,验证这一技术方法在慢性心力衰竭中应用的可行性。材料与方法：本研究共纳入研究对象61人。其中男性43人,女性18人,平均年龄61.5岁。其中正常对照组15人；心力衰竭组46人,其中NYHA功能分级Ⅱ级者11例,Ⅲ级者18例,Ⅳ级者17例。采血前要求空腹8小时,1周内未饮浓茶、咖啡等饮料。所采血液室温下自然凝固1h,收集血清,4℃3000g离心10min,收集上层血清,置-80℃冷冻保存。检测仪器采用美国瓦里安公司(Varian, Inc.)的INOVA600MHz超导核磁共振谱仪,配备脉冲场梯度,带梯度场的三共振探头。检测前将冻干处理过的血清样本在室温下解冻。向离心管中分别依次加入100μlTSP重水溶液(1mg/m1),300μ1血清以及200μ1重水(D2O),充分震荡混匀后,13,000g离心10min。取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用,当样本全部溶解呈匀质透明时,分别采用驰豫编辑脉冲序列(CPMG)和扩散编辑脉冲序列(LED)采集血清样本的数据。对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图,然后调整相位并进行基线校正。对CPMG数据,将0.4～4.4范围内的谱按照每段0.01ppm进行分段积分；对LED数据,将0-6.0范围内的谱按照每段0.04ppm进行分段积分,并将4.6-5.0之间的谱排除。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到Excel文件保存。我们采用SIMCA-P+软件(v11.5, Umetrics, Umea, Sweden)进行多元统计分析。分析前先对数据进行平均中心化和自动标度化处理。采用主成分分析法(PCA)建立判别模型。对数据进行正交信号校正处理(orthogonal signal correction, OSC)。然后采用偏最小二乘法(partial least square, PLS)进行回归分析。结果：1、对照组与心衰组典型血清1H-NMR图谱显示两者血清代谢谱在80.84～0.90ppm,δ1.26～1.30ppm,δ1.32～1.33ppm,84.09～4.10ppm,δ2.22ppm,63.40～4.00ppm,61.19～1.20ppm和61.46～1.48ppm等多个化学位移的波峰大小有显著差异。经过谱峰归属后结果表明心衰组血清中的脂蛋白及糖基化合物的相对含量比对照组高,而丙氨酸等有机酸含量则较对照组低；2、PCA分析表明,对照组与EF<40%心力衰竭组血清代谢组区别最为显著,而另外两组则不易区分；3、用OSC-PLS方法后上述3组两两间分离效果显著改善；4、采用交叉验证和分类变量交换法进行验证,上述方法建立的分类模型准确度和预测度超过85%,模型稳健可靠,可以用来做进一步分析；5、用变量重要性排序(variable importance in projection,VIP)值,载荷权重(loading weights)和相关系数(correlation coefficients)等方法筛选差异代谢物,结果基本一致。结论：1、正常对照组与EF<40%心力衰竭组血清代谢组存在显著差异,而40%<EF<50%心力衰竭组与正常组差别则不明显；2、基于1H-NMR的技术结合正交信号校正的PLS方法能够识别各组之间血清代谢组差异,显著改善分离效果；3、经过多种验证方法证明,OPLS方法建立的分类模型准确度和预测度均很高,模型稳定可靠；4、不同方法筛选的差异代谢物基本一致。第二章运用代谢组学方法评价心肌代谢重构及血清标志物筛选我们在第一章中已经证明,利用基于1H-NMR的代谢组学方法能够检测出EF<40%心力衰竭患者的血清代谢组相对于正常人已经发生了显著改变。在本章中,我们继续利用1H-NMR的代谢组学方法研究不同心肌能量消耗水平血清代谢组是否有差异。并以此为基础筛选能够代表心肌能量消耗的生物标记物,为客观定量评价心肌代谢重构提供重要诊断工具,进而为研究心衰发生发展的代谢机制提供线索。材料与方法：研究对象与血清代谢组学检测方法同第一章。用我们前期已经建立的超声心动图方法测量入选者的心肌能量消耗(MEE)。以MEE为分类变量建立OPLS模型。结果：1、PCA显示高MEE组与低MEE组血清代谢组之间区别显著；2、建立关于MEE的PLS模型发现,经过正交信号校正后PLS模型分离效果最佳,模型准确度和预测度均超过90%,验证结果表明模型稳定可靠；3、以变量重要性排序(VIP)值为筛选标准,选取VIP值大于1的变量,共归属出18种代谢物。再进一步用oneway-ANONA统计方法比较了各组代谢物水平差异,排除了三组间浓度无显著差异的代谢物,筛选出了3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、丙酮(Acetone)、琥珀酸(Succinate)、缬氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methionine)、肌酸(Creatine)等8种代谢物为血清标志物；4、其中丙酮、3-羟基丁酸、琥珀酸与MEE呈正相关(r=0.451,0.452,0.508)；谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、甲硫胺酸与MEE呈负相关(r=-0.257,-0.260,-0.475,-0.420)。筛选出的代谢物水平与患者是否使用ACEI等药物无关。与传统心力衰竭危险因素相关分析表明,丙酮、3-羟基丁酸、琥珀酸与脑钠肽、肌酐、心率呈正相关(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；丙氨酸、甲硫氨酸与脑钠肽(BNP)、心率则呈负相关(P<0.01,P<0.01)。甲硫氨酸与血糖呈负相关(P<0.05)。年龄、体质指数(BMI)、血清总胆固醇、甘油三酯以及尿酸与上述代谢物相关不明显；5、受试者特征曲线(ROC)表明,脑钠肽、丙酮、3-羟基丁酸、琥珀酸的AUC分别为0.98、0.92、0.90、0.86。丙酮诊断慢性心力衰竭,敏感度达89.13%,特异度达80%。3-羟基丁酸诊断敏感度达89.13%,特异度达93.33%。结论：1、不同MEE组的血清代谢组存在显著差异,通过代谢组学方法可以有效进行区分,其中以低MEE组和高MEE组间区别最为显著。2、筛选出与心肌能量消耗相关的8种代谢物,包括3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、丙酮(Acetone)、琥珀酸(Succinate)(以上呈正相关)；缬氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methionine)(以上呈负相关)；中度MEE时升高,高MEE时反而减少的代谢物,肌酸(Creatine);3.丙酮、3-羟基丁酸可作为慢性心力衰竭的小分子血清标志物。第三章基于GC/MS的大鼠心力衰竭模型血清代谢组学研究临床上慢性心力衰竭病人个体差异比较大,加上很难完全去除饮食、情绪等因素的干扰,容易使研究结果发生误差。因此我们在第三章中采用目前常用的冠状动脉结扎法模拟缺血性心力衰竭发病过程,用基于GC/MS的技术方法,以进一步研究心力衰竭大鼠与对照组血清代谢组学差异,为上述结果提供实验证据。材料与方法：SPF级SD雄性大鼠51只,体质量200-300g。随机分为假手术组16只和冠状动脉结扎组35只。用冠状动脉结扎法制备慢性缺血性心力衰竭模型。4周后,在麻醉状态下,切开腹部,用真空取血管快速从下腔静脉抽取静脉血。静置10分钟左右,离心后提取血浆,用于血清代谢组学分析。代谢组学检测采用Agilent7890A GC/5975C MS系统,毛细管色谱柱为Agilent J&W Scientific公司的HP-5MS(30m×250μm i.d.)。检测前样品管内加入120μl色谱甲醇,离心取120μl上清液至高回收率样品瓶中,温和氮气吹干,加入80μ1的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液,然后加入80μlBSTFA试剂(含1%TMCS),70℃下反应60分钟后进行GC/MS分析。采用全扫描形式进行质谱检测,质谱检测范围为50-600(m/z)。在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号,然后导入TagFinder软件进行质谱碎片的保留时间校正、峰对齐和反卷积分析,最后在EXCEL软件中进行后期编辑。数据导入Simca-P软件(版本11.5)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)。结果：1、假手术组16只,存活14只,总存活率87.5%。冠状动脉结扎组35只,存活18只,总存活率51.4%。手术组射血分数(LVEF)显著小于假手术组(47%vs76%,P=0.001)。2、PCA得分图显示,重度心衰组与轻度心衰组和对照组之间均有显著差异,但是轻度心衰组与对照组之间无显著差异。3、可以建立稳定可靠的OPLS-DA模型,并筛选出44种差异代谢物。结论：1、重度心力衰竭的血清代谢组和正常相比发生显著变化,轻度心力衰竭与对照相比改变并不明显,结果和人类的研究一致。2、发现了44种差异代谢物,证明1H-NMR和GC/MS两种方法可以互相补充。3、对重度心力衰竭和对照组之间差异贡献最大的代谢物主要为游离脂肪酸、乳酸、葡萄糖、支链氨基酸等物质。其中游离脂肪酸、血糖、乳酸在EF<40%心衰组中显著升高,与人类的变化一致。而支链氨基酸的结果和我们在人类的研究结果相反。为我们今后开展心衰代谢治疗提供了有价值的信息和线索。