燕麦盐诱导DREB基因的克隆及农杆菌介导的相关DREB基因转化芦荟的研究

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逆境是对植物生长和生存不利的各种环境因素的总称,又称胁迫。植物车其生长周期内会遇到各种各样外界恶劣环境的胁迫,如干旱、霜冻、盐碱和低温等。胁迫使植物生长发育受到抑制,甚至导致植株死亡。这些非生物胁迫造成的危害已经成为农业增产、生态环境改良、实现可持续发展的重要限制因素。因此,阐明植物对环境胁迫信号的应答机制,应用基因工程手段提高植物的抗逆性,已成为基因工程育种的关键和基础性工作。为了进一步深入研究植物抗逆性的分子机制,获得具有自主知识产权的优良抗逆基因,我们利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术快速克隆了耐盐性较强的燕麦中的相关基因片段,用于植物抗逆性和遗传工程研究。 DREB(dehyrdration responsive element binding protein)是一类与逆境胁迫相关的转录因子,它能够识别并结合于与干旱、高盐及低温胁迫应答有关基因启动子区域中的DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件,启动下游抗逆基因的表达,从而在转录水平上调控多个抗逆基因。因此,DREB类转录因子能够综合改良植物的抗逆性状,是迄今为止较为理想的抗逆工程基因。我们采用RACE的方法,首次从燕麦中成功分离了DREB基因片段,该序列全长1057bp,编码348个氨基酸,推测其分子量为328.50 Kda。氨基酸序列分析表明该段燕麦DREB基因序列含有一段核定位信号(NLS)以及氨基酸的DNA结合域(EREBP/AP2)保守区,属于EREBP/AP2基因家族。燕麦DREB基因序列在基因组DNA的结构分析证明,该序列没有内含子。利用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)核定位分析,目前己克隆出的序列前缺少含有起始密码子的一段序列。 芦荟是较重要的一种亚热带经济作物,具有药用价值、美容功效和食品营养价值。随着芦荟产业的不断发展,芦荟产量的要求也越来越高。然而芦荟抗旱不抗寒,不利于芦荟的大规模种植。由于芦荟开花不结实或结实率极低,无法采用传统的育种方法来增强其抗逆性,因此需要基因工程的方法对其进行改良。本研究通过农杆菌介导法将提高植物抗寒能力的水稻OsDREB基因转入芦荟基因组中并得到转基因芦荟,转化所选择的载体为PBT(其上含有OsDREB基因和nptⅡ选择标记基因),受体为库拉索芦荟。1500块左右外植体被农杆菌侵染后经共培养、恢复培养,G418筛选培养后,获得了55棵抗性再生植株,目前已检测的12株植株中有2棵PCR结果呈阳性,初步证明目的基因已经整合至芦荟基因组中。 上述结果为进一步研究植物的抗逆性机制以及应用基因工程手段改良植物的抗逆性奠定了基础。
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