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目的：
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)先天感染可引起新生儿多种畸形和疾病，但HCMV先天感染的致病机制尚不清楚。既往人们的研究热点主要集中在蛋白编码区(cording region，CR)，近年来对于非编码区基因的研究受到广泛关注。既往对HCMV RL7基因的研究均以实验室株作为研究对象，表明HCMVRL7基因区域转录一个1.2kb的非编码RNA。本研究将以HCMV临床株为研究对象，对该片段的基因转录情况进行深入研究。另外，2011年有学者通过深度测序的方法发现一种全新的转录本拼接位点-超级受体位点(super acceptor sites，SAS)。本实验对RL8anti基因的研究过程中同样发现了这种拼接位点的存在。同时应用体外模拟转录的方法验证RL8anti基因中的SAS的存在，并对超级拼接的机制进行探讨。
材料和方法：
一、实验材料
标本为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保存的HCMV临床分离株H株;HCMV H株晚期cDNA文库由实验室前期完成构建;采用反转录、RNA提取、PCR扩增、基因重组、5和3RACE、Northern blot等实验试剂盒;常用实验设备包括Beckman台式低温高速离心机、Bio-rad PCR循环仪、细胞培养箱等;所用数据库及分析软件为基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。
二、实验方法
1、HCMV cDNA文库筛选:从HCMV H株晚期cDNA文库中筛选RL7-RL8基因反义链（RL8-antisense，RL8anti）特异性转录本;
2、Northern blot:明确RL7-RL8anti基因转录本的表达时相及转录本长度;
3、3及5RACE(rapid-amplification of cDNA ends):进一步明确RL7-RL8anti基因转录本的3及5末端位置;
4、体外模拟转录:通过构建重组载体进一步验证RL8anti基因SAS的存在，并对超级拼接的机制进行探讨。
结果：
1、HCMV cDNA文库筛选
本研究共筛选出2个RL7基因及1个RL8anti基因特异的cDNA克隆，RL7及RL8anti基因具有共同3末端，以HCMV AD169株(X17403.1)作为参考株，位于基因组第6338位核苷酸。RL7基因转录本5端位于第7231和7313位核苷酸。RL8anti cDNA克隆所含序列为一个含有部分RL8anti序列和部分UL9基因序列的拼接转录本。拼接的受体位点(acceptor site)为第7778位核苷酸，位于RL8基因区域内，供体位点(donor site)为第17115位核苷酸，位于UL9基因区域内。
2、Northern blot
在HCMV H株L期RNA中检测到RL7-RL8anti四种转录本，长度分别为0.8-1.2kb，1.5kb，2.5-3.0kb及5.5-7.0kb。0.8-1.2kb转录本的表达丰度较高，为一簇转录本。
3、 RACE
临床株中RL7基因及RL8anti基因具有相同的3末端，参照HCMV AD169株序列(X17403.1)，均位于第6338位核苷酸，其上游第6365位核苷酸处可见AATAAA终止信号。RL7基因5端主要集中于第6741至7679位核苷酸及第7779至7802位核苷酸。5RACE实验提示RL8anti基因为拼接转录本，与上游UL9，UL10，UL11和UL13基因呈现广泛拼接，受体位点（acceptor site）相对固定，位于第7777至7779位核苷酸。未获得RL8anti基因转录本的5端的起始位置。
4、体外模拟转录
在转染了含有SAS的RL8anti序列和上游UL11基因部分序列的P1-2质粒的细胞总RNA中，检测到了具有RL8anti序列与UL11部分序列的超级拼接转录本;在转染了含有SAS的RL8anti序列和上游UL13基因部分序列的P1-3质粒的细胞总RNA中，检测到了具有RL8anti序列与UL13部分序列的超级拼接转录本。以上两组体外模拟转录结果显示拼接的受体位点出现在第7777-7779位核苷酸。而用单独含有RL8anti和UL11(或UL13)基因序列的两种质粒共同转染细胞，在提取的总RNA中可检测到RL8anti和UL11(或UL13)各自转录本序列，未发现有超级拼接转录本存在。
将毗邻SAS的部分碱基序列进行同位置换，构建重组载体F1-2、F1-3、R1-2、R1-3、R2-2及R2-3。在转染了R1-2、R1-3、R2-2及R2-3的重组载体细胞的总RNA中，均可检测到超级拼接转录本，转染了F1-2和F1-3的重组载体细胞的总RNA中，未发现超级拼接转录本产生，提示调控这种转录模式的调控序列位于F102和F1-3载体中被置换的核苷酸，即第7779至7794位核苷酸。
结论：
1、HCMV RL7基因在HCMV感染的晚期转录两个转录本，长度为0.8-1.2kb和1.5kb。
2、RL8anti基因中存在SAS，位于第7777至7779位核苷酸。
3、体外转录实验提示SAS介导的超级拼接模式是由前体RNA经过内含子剪切形成，而不是两个成熟mRNA经后期加工形成。
4、决定SAS的调控序列位于与SAS毗邻的第7779至7794位核苷酸。