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衣原体（Chlamydia spp.）是一大类严格细胞内寄生、革兰染色阴性、具有原体和始体两相发育周期的微生物。衣原体广泛分布于世界各地,感染性和致病性较强,是一类重要的人畜共患传染病病原。近年来,青藏高原部分地区牦牛因感染流产衣原体引发大规模流产,给当地畜牧业造成了巨大损失。有关牦牛衣原体病的研究大多局限于血清学方面,关于其分子流行病学研究资料极少。流产衣原体主要感染胎盘组织,引起胎盘发生炎症,造成流产,疫苗接种是防控牦牛流产衣原体病的关键。目前,国内外都成功研制了流产衣原体灭活疫苗,但病原需要在鸡胚卵黄囊膜中培养,提取鸡胚卵黄囊膜存在生物安全风险,而且疫苗生产工艺相对落后,不适应现代疫苗生产企业的生产线,致使迄今国内外尚无商业化的流产衣原体灭活疫苗。因此,开展安全、高效的流产衣原体亚单位疫苗研制成为当务之急。在亚单位疫苗的研制过程中,常选择具有重要生物学功能且免疫原性好的蛋白作为候选抗原,OmcB作为沙眼衣原体和肺炎衣原体的一种黏附分子,在感染宿主细胞的过程中发挥关键作用,但其在流产衣原体感染宿主细胞过程中的作用及其是否可以作为制备亚单位疫苗的候选抗原,迄今尚不清楚。本研究拟首先探索青藏高原牦牛衣原体病流行特征。然后,明确OmcB在流产衣原体感染宿主细胞过程中的作用,进一步将OmcB与不同发育周期中具有重要生物学功能的MOMP、CPAF、inc A蛋白进行组合,制备亚单位疫苗。最后,通过动物试验对制备的亚单位疫苗进行免疫效果评价。期望制备的亚单位疫苗能为牦牛衣原体病的防控提供材料。研究取得以下结果。1.从我国西藏、青海、甘肃和四川四省（区）采集了3352份牦牛拭子样品,包括2654份直肠拭子、698份阴道拭子,其中,西藏采集直肠拭子836份、阴道拭子398份,青海采集直肠拭子1086份、阴道拭子189份,甘肃采集直肠拭子524份、阴道拭子70份,四川采集直肠拭子208份、阴道拭子41份。荧光定量PCR检测结果显示,青藏高原地区牦牛衣原体感染总阳性率为26.8%（899/3352）,直肠拭子中衣原体的阳性率为24.3%（644/2654）,阴道拭子中衣原体的阳性率为36.5%（255/698）;不同地区衣原体阳性率差异较大,西藏阳性率最高,为44.9%（554/1234）,青海的阳性率为19.8%（253/1275）,甘肃的阳性率为12.0%（71/594）,四川的阳性率最低,为8.4%（21/249）;流产衣原体、家畜衣原体和鹦鹉热衣原体是主要的流行种,阳性率分别为33.6%（302/899）、61.7%（555/899）和17.0%（153/899）;omp A基因分析表明,流产衣原体十分保守,而家畜衣原体表现出一定的遗传多样性。从西藏采集牦牛938份血清样品,采用ELISA检测,结果显示,流产衣原体抗体阳性率为11.1%（104/938）。2.成功构建了pET-30a-MOMP、pET-30a-OmcB、pET-30a-CPAF、pET-30a-inc A表达载体,诱导表达并纯化出带His标签的4种重组蛋白,将纯化的重组蛋白与佐剂按1:1（v/v）比例混合、充分乳化得到亚单位疫苗。重组OmcB免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,western blotting检测显示,多克隆抗体可与流产衣原体OmcB特异性结合,表明流产衣原体OmcB具有免疫原性。通过黏附和感染抑制试验,明确了OmcB是一种分布在流产衣原体外表面的蛋白质,具有黏附作用。用定点突变的方法成功构建了OmcB XBBXBX基序缺失体OmcB1-310Δmotif1,OmcB1-310Δmotif2和OmcB1-310Δmotif1,2,通过感染抑制试验,明确了流产衣原体OmcB N端的第1个XBBXBX基序对于黏附宿主细胞至关重要。3.将小鼠随机分为6组,分别为PBS组（阴性对照组）,鸡胚卵黄囊膜甲醛灭活疫苗组（阳性对照组）,MOMP+OmcB组,CPAF组,inc A组,Mixture组（4种重组蛋白混合组）。小鼠免疫后,食欲、精神状况良好,接种部位未出现不良反应。各重组蛋白均能在小鼠体内诱导产生较高水平的特异性抗体。灭活的流产衣原体能够显著刺激Mixture组小鼠脾细胞增殖（P＜0.05）,诱导脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2。攻毒后各组小鼠组织器官均能检测到流产衣原体,主要分布在子宫和胎盘中,除inc A组外其他各免疫组子宫和胎盘中流产衣原体载量均显著低于PBS组（P＜0.05）;组织病理学检查结果显示,PBS组、inc A组小鼠子宫中有大量的炎性细胞浸润,胎盘组织可见蜕膜层细胞坏死,滋养层条状坏死,迷路层多灶性坏死,CPAF组和MOMP+OmcB组小鼠子宫和胎盘中有少量的炎性细胞浸润,而Mixture组子宫和胎盘未见明显的病理变化;Mixture组小鼠产仔率为73%,高于其他各组。4.根据小鼠试验结果,对保护效果最好的4种重组蛋白（Mixture组）进行绵羊保护效果评价。免疫攻毒组怀孕绵羊13只,非免疫攻毒组怀孕绵羊10只,空白对照组怀孕绵羊11只。结果显示,免疫攻毒组怀孕绵羊全部产生较高水平的特异性抗体;攻毒后第2天免疫攻毒组和非免疫攻毒组的试验羊体温全部升高（≥40°C）,攻毒后第4天免疫攻毒组平均体温显著低于非免疫攻毒组（P＜0.05）;免疫攻毒组绵羊阴道拭子衣原体载量显著低于非免疫攻毒组（P＜0.01）;相对于非免疫攻毒组,免疫攻毒组胎盘组织病理变化更轻;免疫攻毒组流产率为38.5%,非免疫攻毒组流产率为100%。本研究明确了我国青藏高原地区牦牛主要感染流产衣原体、家畜衣原体和鹦鹉热衣原体。明确了OmcB在流产衣原体感染宿主细胞过程中发挥黏附作用,OmcB N端的第1个XBBXBX基序对于黏附宿主细胞至关重要。制备了不同蛋白组合的亚单位疫苗,其中含4种重组蛋白的亚单位疫苗对怀孕小鼠的免疫保护效果优于其他各组,该疫苗对怀孕绵羊也具有较好的免疫保护效果。本研究结果为今后牦牛衣原体病的防控奠定了基础。