研究背景：心源性脑栓塞(Cardiogenic Cerebral Embolism, CCE)是指由来自心脏的脱落栓子阻塞脑供血动脉,.从而引起相应供血区脑组织的急性缺血性坏死,占整个缺血性卒中的20%,其高危因素包括房颤导致的左房血栓、二尖瓣狭窄、左房粘液瘤、感染性心内膜炎以及冠心病等。CCE急性期,由于心脏内栓子的不稳定或合并严重的心脏器质性病变,因此可能出现再栓塞或心功能衰竭。心源性栓子来源未清除者,易反复栓塞,起病10天内脑栓塞复发率可达10-20%,1年内复发率在60%以上,复发者恢复慢、病死率高。近年来,大量临床研究表明,CCE急性期为清除附壁血栓、瓣膜上的赘生物或矫正器质性病变,而在体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)下行心脏手术势在必行。心源性栓子脱落后,沿血流进入颅内动脉血管,易阻于颅内大血管或血管分叉处,其中大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)供血区发生栓塞的概率最大(77.78%),造成栓塞而致动脉血流突然中断。发生栓塞后,相应供血区的脑组织出现急性缺血缺氧,形成中心梗死区,以及周边的相对缺血区,即缺血半暗带(Ischemic penumbra, IP),IP区脑组织细胞尚能维持自身离子平衡,仍为可逆性修复的脑组织。血供不足导致脑细胞能量物质缺乏,脑细胞代谢失衡,发生病理改变的主要机制包括兴奋性毒性、氧化和硝化应激、炎症反应和细胞凋亡等。近年来,虽然CPB装置和器官保护措施不断完善,但CPB的脑损伤依然是心脏术后主要的并发症之一。有许多相关基础和临床研究报道,CPB术后的短期认知异常、记忆力减退发生率为30%-65%。CPB脑损伤的机制十分复杂,主要是脑组织缺血性损伤(微栓塞和灌注不良)和炎症反应损伤(全身炎症反应综合征systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。其中,由于血液接触CPB管道异物内表面、缺血再灌注损伤、肠道吸收的内毒素、注射的肝素和鱼精蛋白、手术创伤及低温使血液系统激活,导致的全身炎症反应综合征(SIRS)在脑损伤中起着重要作用。在此过程中机体释放大量的细胞因子[白介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等]、补体降解产物和一氧化氮(NO)。这些细胞因子一方面通过炎性反应造成微血管内皮细胞损伤、血管通透性增加等,使相应的供血区缺血缺氧而致脑损伤；另一方面,炎症反应还使脑组织神经元细胞变性坏死。而在脑栓塞急性期这一特定病理条件下进行心脏手术一直是困扰心脏外科大夫的重要临床问题。一方面脑栓塞后脑组织因急性缺血而遭受严重损伤,而CPB下进行的心脏手术,因CPB的控制性低血压、血液稀释、肝素化、非生理性转流,以及可能产生的微栓塞和炎症反应,可加重脑损伤；但另一方面,脑栓塞后短期内的复发率高,且脑栓塞后早期可加重心力衰竭的进程,因此手术显得迫切而必须。直报道认为脑栓塞恢复时间一般为6～8周,前2周内为病变不稳定期,2个月后行心脏手术较为安全。我们前期的临床观察和研究认为,在脑栓塞后2周内进行心脏手术,患者所承担的风险在可接受范围内。目前,有关脑栓塞后心脏手术的相关研究不多,以回顾性临床研究为主,缺乏系统的基础性研究,使得临床医生对脑栓塞后行体外循环心脏手术的脑损伤机制以及可采取的脑保护措施等方面的困惑极大。因此,脑栓塞急性期这一特定病理条件下行体外循环的动物实验研究,对探明其脑损伤机制及指导临床上脑栓塞急性期心脏手术具有重大意义。本研究主要包括以下两部分：1.建立兔大脑中动脉栓塞模型的研究；2.建立兔脑栓塞急性期体外循环模型,并通过观察兔脑影像学表现和检测血清生化指标,研究脑栓塞急性期体外循环的脑损伤机制。第一部分中,通过经眶上缘入路,直视下凝断左侧大脑中动脉主干,建立兔大脑中动脉脑栓塞模型,筛选出合格的脑栓塞模型兔,为后继实验做准备。第二部分中,通过胸骨正中切口开胸,实行升主动脉插灌注管、右心房插引流管、心脏停跳,建立体外循环。通过影像水平和分子水平测定脑细胞损伤程度及脑代谢改变,明确脑损伤的程度与炎症反应及脑血管功能变化之间的相关性。第一部分兔大脑中动脉栓塞模型的建立目的：探索建立稳定可靠、高效经济的兔大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,为脑栓塞病理生理和诊治的基础研究提供理想的动物模型,在本研究为后续研究脑栓塞急性期体外循环的脑损伤机制做模型准备。方法：(1)实验动物及分组：54只成年健康新西兰白兔,体重2.0～2.5Kg,平均2.3±0.45Kg,由南方医科大学南方医院动物中心提供。采用完全随机设计方法所有动物兔随机等分为三组,每组18只。A组空白对照组(n=18),B组为脑栓塞24h后体外循环组(n=18),C组为脑栓塞1周后体外循环组(n=18)。(2)建立兔大脑中动脉栓塞(MCAO)模型及神经功能测定：B、C组实验兔,经眶上缘入路,直视下凝断左侧大脑中动脉主干,建立兔大脑中动脉脑栓塞模型。麻醉清醒后按5分制评分标准进行评分：0分,无神经系统症状；1分,不能完全伸展对侧前爪；2分,爬行时转圈,3分,向对侧倾倒；4分,不能自行行走,意识丧失。评分为1-3分的入选。(3)A组空白兔、B组术后24小时及C组术后1周,行MRI平扫检查,评估栓塞效果。(4)数据统计：采用SPSS18.0.0软件进行统计分析,数值采用均数±标准差(x±SD)表示,图表中数据采用均数及标准差(SD)或95%可信区间(CI)表示,计数资料通过相对数来描述。结果：1.术中均能清晰探及兔左侧大脑中动脉,发现6只兔大脑中动脉走形有变异,占16.7%,变异方式多为大脑中动脉主干长度及分支数量差异。手术最长耗时75min,最短耗时50min,平均耗时61.55±5.82min。术后存活兔36只,存活率100%,未出现术后出血、切口化脓感染及颅内感染等并发症；术后行为学测定中所有兔均有不同程度的神经系统症状：26只兔不能完全伸展对侧前爪,占72%；10只兔爬行时转圈,占27.8%；无向右侧倾倒、完全瘫痪或昏迷者,所有兔合格入选后续实验。2.A组空白兔头颅MRI检查未见异常,B组兔在栓塞24h、C组兔在栓塞一周后,头部MRI在T1WI上均无明显异常,T2WI显示：对比MCAO术前(图2),MCAO术后(图3)可见大脑中动脉相应供应区的异常高信号。结论：采用眶上缘入路凝断大脑中动脉术建立的兔脑大脑中动脉栓塞模型具有确切可靠、高效可行的特点,是进行脑栓塞急性期体外循环脑损伤机制和脑保护研究的较理想模型。第二部分兔脑栓塞急性期体外循环脑损伤机制的研究目的：1.在第一部分的基础上,探索建立兔脑栓塞急性期体外循环模型。2.通过观察兔脑组织影像学变化和监测脑损伤指标,研究兔脑栓塞急性期行体外循环的脑损伤机制和脑损伤程度,为临床上心源性脑栓塞急性期行心脏手术的安全性和可行性提供理论依据。方法：1.实验动物及分组：54只成年健康新西兰白兔,体重2.0-2.5Kg,平均2.3±0.45Kg,由南方医科大学南方医院动物中心提供。采用完全随机设计方法所有动物兔随机等分为三组,每组18只。A组空白对照组(n=18),B组为脑栓塞24h后体外循环组(n=18),C组为脑栓塞1周后体外循环组(n=18)。2.建立兔脑栓塞急性期体外循环模型：实验兔接受经眶上缘入路大脑中动脉凝断术后,胸骨正中切口开胸,升主动脉和右心房分别缝荷包线,升主动脉插灌注管,右心房插引流管,主动脉阻断后,由主动脉根部注入停跳液20m1,实现心脏停跳,建立体外循环,术中进行体温、有创血压。1小时体外循环结束后,开放主动脉根部,复温、辅助循环及撤除体外循环。3.标本采集及指标检测：分别在兔体外循环前、体外循环20min后和体外循环60min后采取兔静脉血3m1,1小时内用3000转/分钟离心10分钟,使用不含热原和内毒素的试管取上清液,标号后,在一20℃的冰箱内保存。24小时后采用ELISA法测定血浆中S100β蛋白、肿瘤坏死因子(TNF-α)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及一氧化氮(NO)含量。4.A组、B组及C组兔在体外循环术后1小时内行头颅CT平扫检查,观察兔脑组织影像学变化。5.数据分析：采用SPSS18.0.0软件进行统计分析,数值采用均数±标准差(x±SD)表示,图表中数据采用均数及标准差(SD)或95%可信区间(CI)表示。组间比较采用方差分析(ANOVA)法计算F值,两两比较采用LSD-t检验；两变量相关性分析采用Pearson相关分析或Spearman相关分析。P值小于0.05为具有统计学差异。结果：1.B组、C组兔于体外循环术后恢复自主呼吸后予行64排螺旋CT平扫检查,层厚1mm,均未见明显出血灶或新的缺血灶,原有左侧缺血灶,未见明显扩大。2.术前三组兔的心率、平均动脉压及体温进行组间比较,方差分析P值分别为0.847、0.407、0.870,无统计学差异,所有54只均未出现麻醉意外,B组、C组兔均顺利建立体外循环并转流成功,转流期间,血压平稳,B组(59.17±3.97mmHg)与C组(58.80±4.43mmHg)相比,t=0.237,P=0.81,无统计学差异。开放主动脉后,复温、辅助循环,心脏顺利复跳,平均动脉压B组(64.39±3.26mmHg)与C组(67.72±3.29mmHg)相比,t=-3.057,P=0.004<0.05,有统计学差异。麻醉苏醒后,B组兔有2只未能恢复自主呼吸,其余兔均顺利恢复自主呼吸,但呼吸动度较弱。C组有1只死于心脏复跳失败,其余兔顺利复跳并恢复自主呼吸。3.血浆S100β浓度检测结果,体外循环前A组与B组和C组之间存在显著差异(P值均小于0.001),B组和C组之间无显著差异(P=0.262>0.05),但从均值看,B组高于C组。B组、C组不同时间点血浆S100β蛋白浓度的比较无显著差异,体外循环20min(t=-0.820,P=0.42>0.05),体外循环60min(t=0.294,P=0.772>0.05),随体外循环开始,B组、C组S100β蛋白浓度迅速上升,到体外循环60min结束后攀升至最高。4.血浆TNF-α浓度检测结果,体外循环前A组与B组和C组之间存在显著差异(P值均小于0.001),B组和C组之间也存在显著差异(P<0.001),B组均值高于C组。B组、C组不同时间点TNF-α浓度t检验比较,体外循环20min(t=-1.56,P=0.136),体外循环60min后(t=-0.683,P=0.502)。随体外循环进行,血浆TNF-α浓度逐渐升高；B组、C组不同时间点S100β蛋白与TNF-α相关性采用Pearson相关性分析呈正相关。5.血浆MBP检测结果分析：空白组A组血浆MBP浓度3.39±0.34pg/ml,B组、C组体外循环前MBP浓度分别为3.50±0.35pg/ml.3.55±0.31pg/ml,ANOVA分析得F=1.155,P=0.323>0.05,三组均数无显著差别。B组、C组内可见随体外循环的进行,血浆MBP浓度直线上升。B组、C组不同时间点血浆MBP浓度比较,体外循环20min(t=0.215,p=0.831>0.05),体外循环60min后(t=1.803,P=0.08>0.05),均无显著差异。6.空白对照组A组血浆NO浓度为42.17±3.01ummol/L、B组体外循环前52.10±1.84ummol/L、C组体外循环前55.97±5.12ummol/L,ANOVA分析得F=70.72,P<0.001,三组之间有显著差异,在此之后采用LSD-t检验两两比较,A组与B组(P<0.001),A组与C组(P<0.001),B组与C组(P=0.002<0.005),均有显著差异。B组、C组不同时间点血浆NO浓度t检验比较,体外循环20min(t=-3.749,P=0.001<0.05),差异有统计学意义,体外循环60min后(t=-1.434,P=0.161>0.05),无显著差异。B组、C组不同时间点血浆NO浓度变化规律为,可见在体外循环开始20min内,血浆NO浓度显著升高,然后逐渐下降。结论：1.模拟临床实际建立的兔脑栓塞急性期体外循环模型具有成功率高、稳定、可行的特点,是进行脑栓塞急性期体外循环相关脏器损伤机制研究和对其进行干预的较理想模型。2.体外循环脑损伤的机制与机体炎症反应及脑血管舒缩功能的改变密切相关,而脑栓塞早期24小时与1周行体外循环出现的脑损伤无明显差别。