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目的建立一种应用MALDI-TOF MS检测靶板中微滴细菌生长的方法,来快速检测分纯菌落和血培养瓶中肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性表型。初步评价该方法的准确性,为缩短细菌感染性疾病的报告时间的可能性进行初步研究。方法1.选取北部战区总医院细菌标本库中留存的20株耐碳青霉烯类(亚胺培南)肺炎克雷伯菌,收集菌株的基本信息,分别采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析、K-B法和PCR扩增常见耐药基因的方法检测菌株的药物敏感性,并用MALDI-TOF MS进行菌株的鉴定与同源性分析。2.选取20株临床收集的亚胺培南敏感肺炎克雷伯菌,与第一部分收集的20株耐药菌一起,对它们的分纯菌落进行基于肉汤稀释法原理的MALDI-TOF MS快速药物敏感性检测。将含有或不含有亚胺培南的培养液与细菌在金属靶板上形成微滴共同生长,在4h的孵育时间后通过MALDI-TOF MS能否对靶板上的细菌成分提供正确鉴定(鉴定分值≥1.7)的方式来明确细菌在有无抗生素存在下的生长情况,从而获得细菌的药物敏感性表型结果,初步评价该方法的准确性。3.从实验菌中选取亚胺培南敏感与耐药肺炎克雷伯菌各8株,用人工模拟血流感染患者的血培养样本的方法,对16份人工模拟血培养样本直接进行基于MALDI-TOF MS的细菌药物敏感性检测。并分别采用差速离心法、分离胶促凝管法和直接稀释法对阳性血培养样本进行前处理,评价不同前处理方法结果的准确性。结果1.20株肺炎克雷伯菌分离自急诊、神经外科等多个科室,来源于痰、尿液、咽拭子等多个标本类型,均为多重耐药菌,且均对亚胺培南耐药,共检出KPC、NDM、KPC+NDM、KPC+IMP以及阴性五种基因型,MALDI-TOF MS同源性分析结果显示20株菌间的亲缘关系相对较远。2.采用MALDI-TOF MS鉴定结合微滴短时培养,可在5h内提供40株肺炎克雷伯菌对亚胺培南敏感/非敏感的定性结果。采取三次平行试验中位数的结果判读,得到了100%的有效试验率,对20株敏感菌和20株耐药菌检测的灵敏度和特异性均达到了100%。3.16株模拟血培养样本均在12h内阳性报警,亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌相比敏感菌报阳所需的时间更长。差速离心法、分离胶促凝管法和直接稀释法经MALDI-TOF MS实验后均得到了100%的有效试验率,三种方法对16份样本检测的特异性均为100%,其中直接稀释法对16份样本检测的灵敏度也为100%,另外两种方法的灵敏度为87.5%。结论本研究所选取的耐药肺炎克雷伯菌涵盖了不同的来源科室、标本类型、耐药机制和耐药程度,使后续方法的结果更具有通用性。采用本研究的快速检测方法,可在5h内提供肺炎克雷伯菌分纯菌落对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性,相比常规实验室方法可缩短13-19h的检测时间。另外结合相应前处理方法,可直接对模拟阳性血培养中的培养物进行快速药物敏感性检测,减少42h以上的血流感染报告周转时间。本实验的方法准确度较高,可作为一种检测肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物表型敏感性的快速筛查方法,从而更早为临床治疗提供参考依据。