目的:在泌尿系统范畴里,肾细胞癌是最常见的癌症之一。肾癌的发病早期临床表现缺乏特点,疾病早期无明显临床症状,致使很大一部分患者在确诊肾细胞癌时,患者体内的癌细胞已经发生远处转移。晚期肾细胞癌患者对放射治疗和化学药物治疗均不敏感,免疫靶向治疗容易产生耐药现象,所以对肾细胞癌的最佳管理办法就是早期诊断早期治疗。PLK1因子具有活化或抑制其调控的底物而调节细胞增殖周期过程的作用。PLK1的上调与多种癌症相关,并且PLK1已被证实为许多癌症的预后标志物。已有研究证明,微小染色体维持蛋白3(MCM3)对包括DNA复制细胞增殖周期等过程均具有重要效应。然而,MCM3在肾透明细胞癌中是否发挥同样效应目前尚不清楚。我们依据以往研究所了解的PLK1与MCM3的生物学功能,进一步探究了二者之间的相互作用方式,PLK1调控MCM3的功能位点,MCM3蛋白被PLK1磷酸化修饰后对肾细胞癌增殖与凋亡的影响,即MCM3与PLK1联合在肾细胞癌发生发展过程中所起作用的详细机制,以确定关键分子标志物,为肾癌诊断及治疗奠定科学的实验与理论基础。研究方法:1.通过免疫印迹和免疫组织化学的方法对肾癌和癌旁组织的PLK1与MCM3蛋白表达情况进行检测,同时对肾癌细胞系中这两个蛋白的表达情况及定位进行研究,探索PLK1蛋白的表达水平与患者临床预后之间的关系。2.通过克隆形成,CCK-8实验和EdU细胞增殖实验等分别探索PLK1与MCM3对肾癌细胞系786-O、ACHN细胞体外功能的影响;其次,通过裸鼠成瘤实验验证PLK1和MCM3在体内对细胞生长增殖以及凋亡的影响。3.通过生物信息网站预测分析及免疫共沉淀、Phos-tag标签实验、免疫荧光、免疫印迹等实验验证和确定PLK1对MCM3的作用方式以及作用位点。4.通过建立稳定转染细胞系、共转染细胞系、克隆形成技术、流式细胞技术和免疫印迹技术等方法探讨PLK1作用于MCM3蛋白,对肾癌细胞功能的影响以及涉及到的下游通路。5.利用裸鼠成瘤实验和免疫组化技术等实验检测PLK1对MCM3的磷酸化作用以及结合MCM3s112位点的功能,进一步验证PLK1与MCM3之间的调控关系及作用机制,及其对细胞增殖凋亡的影响。结果:1.随机选取的90例肾细胞癌患者肿瘤组织较癌旁组织中及肾细胞系较正常上皮细胞中,PLK1均呈高表达趋势。同时发现MCM3在两组中的表达与PLK1的表达趋势基本一致。免疫组织化检测结果表明,PLK1蛋白在肾癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织,并且随着肿瘤级别的增高,PLK1蛋白的表达水平递增。PLK1的表达水平与肾癌患者的预后有明显的相关性,患者肿瘤直径、肿瘤复发率及肿瘤分期与PLK1的高表达均有正相关关系;2.构建了过高和敲低PLK1与MCM3表达的786-O和ACHN稳定转染细胞系。CCK8实验显示,过表达PLK1或者MCM3的786-O和ACHN的稳定转染细胞系的增殖效率对比空白组细胞明显增高,而分别敲除PLK1或者MCM3后,细胞的增殖效率明显降低(P<0.05)。克隆形成结果提示,过表达PLK1或者MCM3的786-O和ACHN的稳定转染细胞系的细胞成团数对比空白组细胞明显增高,而分别敲除PLK1或者MCM3后,细胞的成团数明显减少(P<0.05)。EdU细胞增殖实验的结果呈现与CCK8和克隆形成相同的趋势;3.在过表达PLK1的786-O细胞系中,进行免疫共沉淀实验,结果显示PLK1与MCM3有明显的结合现象。进一步免疫荧光实验证实,PLK1与MCM3主要结合于细胞核内。通过Phos-tag实验检测发现,PLK1与MCM3之间存在磷酸化的作用,在高表达PLK1的786-O细胞中,MCM3呈高水平的磷酸化现象。结合上述实验结果,在生物信息网站上对PLK1与MCM3之间的关系进行进一步预测,发现PLK1对MCM3的磷酸化位点可能在Ser112,通过构建MCM3Ser112位点突变质粒,结合Phos-tag实验发现,在过表达PLK1的细胞中,同时共转染MCM3S112A质粒,发现与对照组相比,MCM3的磷酸化现象明显减少,进一步证实PLK1对MCM3的磷酸化修饰在Ser112位点;4.在过表达PLK1的786-O和ACHN细胞中,克隆形成实验证实,细胞的增殖能力较对照组明显增强(P<0.05),而在细胞共转染了MCM3s112A质粒组中,这种趋势被明显的逆转。同样的趋势也表现在细胞周期实验中,在MCM3s112A实验组中,明显逆转了PLK1对细胞周期的作用,而使G2/M期明显增多(P<0.05)。通过流式细胞术,共转染MCM3s112A细胞组与过表达PLK1组比较发现,前者细胞凋亡数量明显增多,而P-MCM3对肾癌细胞也具有促进增殖同时抑制凋亡作用;并且过表达PLK1后,突变掉MCM3Ser112位点后,可以逆转PLK1对细胞的作用,进一步证实PLK1通过调控MCM3的磷酸化而影响肾癌细胞的增殖与凋亡;5.裸鼠成瘤动物实验与体外实验结果一致,在皮下注射过表达PLK1的ACHN细胞的小鼠肿瘤体积明显比对照组增大,而在PLK1与MCM3s112A共转染的ACHN细胞组中,可逆转这种趋势。通过免疫组化实验证实,在PLK1过表达组中,Ki-67蛋白表达较共转染MCM3s112A组中明显增高,进一步证实PLK1-MCM3调节轴在肾癌增殖凋亡中的作用。结论:1.肾癌细胞系(ACHN、786-O、CAKI和769-P)细胞和肾细胞癌患者的癌组织中PLK1蛋白的表达水平分别较永生化肾小管上皮细胞系(HKC)细胞和癌旁组织呈显著升高。2.PLK1蛋白高表达可促进肾癌细胞的增殖率,PLK1蛋白低表达可减低肾癌细胞的增殖速度。3.肾癌肿瘤组织中,表达PLK1蛋白的细胞数量和水平与患者的疾病的严重程度有重要关联性,高表达PLK1蛋白患者肿瘤生长加速,易于转移和复发,平均存活时间低于低表达者。4.肾癌组织中MCM3呈现高表达。PLK1与MCM3在体内可互相结合,PLK1致MCM3磷酸化。5.MCM3 Ser112点突变质粒(MCM3 S112A)共转染的PLK1高表达786-O和ACHN细胞株MCM3的磷酸化明显受到抑制;PLK1对MCM3的Ser112位点进行磷酸化的作用,促进肾细胞癌增殖并抑制凋亡;MCM3 Ser112点突变影响PLK1对MCM3的磷酸化,抑制肾癌细胞增殖,促癌细胞凋亡。6.基本明确了,PLK1作用MCM3 Ser112位点,对MCM3蛋白进行磷酸化作用,MCM3 Ser112位点可能会成为肾细胞癌临床治疗的新靶标,用于开发新的靶向治疗药物。