采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术，建立赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)的高灵敏的TRFIA的检测方法，并研制具有我国自主知识产权的快速、灵敏的OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒，提高我国在毒素超微量免疫检测的水平，解决我国农产品安全检测方面的一些迫切要求，应对国际上技术壁垒的挑战。 方法 1.OTA的TRFIA研究：首先采用碳二亚胺法，制备人工抗原OTA-KLH。以OTA-KLH免疫大白兔制备多克隆抗体。以OTA-BSA免疫BALB/c鼠，制备抗OTA单克隆抗体。选择包被浓度、标记条件、反应步骤、反应方式，配制增强液、洗液，编制全自动操作软件；以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪，建立多克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪，建立单克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。组建OTA-TRFIA检测试剂盒。按照标记免疫试剂要求，分别对OTA-TRFIA试剂盒进行灵敏度、精密度、准确度、回收率、特异性、稳定性考核，应用OTA-TRFIA试剂盒检测国际质控，并与进口的OTA-ELISA试剂盒进行对照。 2.AFB1的TRFIA研究：将AFB1-BSA免疫新西兰大白兔得到抗AFB1多克隆抗体。用黄曲霉毒素B1与辣根过氧化酶的联结物(AFB1-HRP)包被96孔板为固相抗原，以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪，采用间接竞争免疫分析方法建立AFB1-TRFIA。组建AFB1-TRFIA检测试剂盒，对其进行考核，并与ELISA试剂盒进行对照。 结果 1.制备了可以用于免疫和筛选的OTA-KLH人工抗原，得到了抗OTA多克隆抗体和单克隆抗体。采用DTTA法，制备了Eu3+-羊抗兔抗体和Eu3+-羊抗鼠抗体。配制了所有的相关试剂，编制了全自动的分析软件，组建了OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒。 2.应用多克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.02μg/L，测量范围为0.02μg/L-400μg/L，批内和批间变异分别为2.6％和5.2％，平均回收率为95.8％。OTA-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为0.195g/L，1.018g/L和5.314g/L。 3.应用单克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.03μg/L，测量范围为0.03μg/L-1000μg/L，批内和批间变异分别为3.7％和5.3％，平均回收率为94.2％。间接竞争OTA-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为0.33±0.02μg/L、1.44±0.08μg/L和5.22±0.12μg/L，样品经TRFIA和进口的ELISA试剂盒同时检测OTA，两者的相关系数为0.925，结果相符。 4.OTA-TRFIA试剂盒测定英国环境食品和农产品部中心科学实验室提供的OTA质控，结果为理论靶值的0.94-1.14，符合0.56-1.44之间的要求，说明OTA-TRFIA可以用于谷物中OTA的检测。 5.应用多克隆抗体建立的AFB1-TRFIA方法的灵敏度达到0.0039μg/L，AFB1-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为0.034±0.004μg/L、0.160±0.011μg/L、1.048±0.170μg/L，方法的批内、批间变异系数平均为4.9％和8.9％。平均回收率为97.2％，AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA试剂盒同时检测样品，两者的相关系数为0.917，说明结果相符。 6.采用加速实验的方法考核OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA试剂盒，其有效期可在一年以上，而且可以耐受夏天高温的邮寄。 结论 1.研究表明，国内外首先报导的OTA-TRFIA是目前OTA检测中最灵敏的方法之一，该分析方法稳定性好、可测范围宽、大大好于OTA-ELISA商品化试剂盒。测定英国环境食品和农产品部中心科学实验室提供的OTA质控，结果高度符合，可以用于谷物中OTA的实际检测，具有很好的应用前景。 2.AFB1-TRFIA是目前报导的AFB1检测中最灵敏的方法之一，该分析方法稳定性好，灵敏度和测量范围都高于AFB1-ELISA商品化试剂盒一个数量级，将AFB1检测提高到一个新的高度。 3.研制的具有我国自主知识产权的高灵敏、快速OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒盒经过考核，各项指标符合标记免疫试剂的要求，完成了产业化转化的应用基础研究，进行了工艺设计，具有很好的应用前景。