【摘 要】
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细菌性病害是淡水养殖产业重要威胁之一,维氏气单胞菌(Aer omonas veronii)是其中的代表性病原菌。特别是近年来国家对于水产养殖用药规范的颁布导致人们对绿色高效的微生物制剂高度重视。烈性噬菌体是普遍存在于自然界的细菌杀手,其专一裂解宿主增殖的特性具有定向杀菌、高效便捷的优势,是理想的病原菌防治药物。本研究以G-菌维氏气单胞菌AV1212为宿主,从污水样品中分离得到双链DNA长尾噬菌体A
【基金项目】
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省部级项目:湖南省科技重大专项(2017NK1030); 省部级项目:湖南省重点项目(2016NK2129); 省部级项目:湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心项(20134486); 国家级项目:国家自然科学基金(31770106); 国家
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细菌性病害是淡水养殖产业重要威胁之一,维氏气单胞菌(Aer omonas veronii)是其中的代表性病原菌。特别是近年来国家对于水产养殖用药规范的颁布导致人们对绿色高效的微生物制剂高度重视。烈性噬菌体是普遍存在于自然界的细菌杀手,其专一裂解宿主增殖的特性具有定向杀菌、高效便捷的优势,是理想的病原菌防治药物。本研究以G-菌维氏气单胞菌AV1212为宿主,从污水样品中分离得到双链DNA长尾噬菌体Avs-1。在不断传代转接培养过程中分离了一株噬菌体抗性菌AV0110。对两株菌进行基于reads、SNP的全基因组比对分析及突变区域的二次测序验证,发现编码磷酸甘露糖变位酶(Phomannomutase,PMM)的man B基因发生了移码突变。磷酸甘露糖变位酶与细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)O-抗原的合成密切相关。特异性吸附是噬菌体引发感染所必需的步骤,G-菌脂多糖的O-抗原是常见的噬菌体吸附受体。因此,AV0110的磷酸甘露糖变位酶的突变可能导致噬菌体Avs-1无法吸附。通过在抗性突变菌A V0110中表达man B基因,发现工程菌抗性丢失,意味着man B的突变就是AV0110获得抗性的原因。本研究对噬菌体Avs-1基因组中潜在的内溶素Lys40在大肠杆菌中进行了异源表达,发现Lys40诱导表达后能显著抑制大肠杆菌的生长,但无法裂解大肠杆菌。利用生物信息学方法,对Avs-1噬菌体基因组中的60个ORF中具有穿孔素特征的氨基酸序列进行分析,发现ORF42和ORF44具有跨膜结构域且C端具有亲水性和高电荷。ORF42还含有信号肽,且两者都属于假定蛋白,故推测它们可能参与了噬菌体Avs-1对宿主的裂解。于是构建了它们单独表达和共表达载体。本研究对维氏气单胞菌AV0110的噬菌体抗性和噬菌体Avs-1裂解宿主相关的酶进行了研究。实验证明噬菌体抗性突变能稳定遗传,基因组分析表明噬菌体抗性与CRISPR-Cas系统无关,全基因组比对结果显示与man B基因的突变相关。基因组特征分析和实验表明Avs-1基因组中无溶源性因子和毒力因子,可能存在与已知蛋白序列差异较大的穿孔素或具有新的裂解机制。对维氏气单胞菌和新型噬菌体A vs-1的研究扩充了噬菌体的基因库,为进一步研究病原菌与噬菌体的相互作用和维氏气单胞菌的防治提供了理论依据。
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