滥用抗生素对畜禽养殖业的发展危害巨大,是重要的公共卫生学问题之一。乳酸菌是益生菌的主要代表,可以有效抑制肠道病原菌的侵袭,具有抗生素替代品的潜能。本研究从猪粪便分离乳酸菌,通过抑菌活性和耐受性试验筛选益生作用良好的乳酸菌菌株,体外实验评估对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性。将筛选出的乳酸菌制备复合制剂,优化复合菌株的发酵工艺,并评价该复合制剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的影响。本研究为畜禽绿色健康养殖提供依据和保障,研究内容与结果如下:1.猪源乳酸菌的分离鉴定及生物学评价为筛选出生物活性优良的乳酸菌,以乳酸菌耐受性的角度出发,从健康猪粪便中分离得到41株菌株,通过黏附定植、抗菌活性、耐受性等实验对乳酸菌理化特征比较,筛选一株为鼠李糖乳杆菌(B8),两株为动物乳杆菌(B2,T20)。耐受性实验结果表明,B2、T20,B8菌株经60℃热处理15 min后存活率高于70%。B2、B8、T20在pH=2的培养基中培养4h的存活率超过37%。在0.5%的胆汁盐浓度下培养4h,B2、B8、T20存活率超过30%。黏附实验结果表明:不同菌株之间自聚合能力、对病原菌共凝集的能力、表面疏水性有差异(P<0.05)。其中T20的自聚合能力性最高,为66.14%。T20的与病原菌共凝集能力为59.36%。T20和B8表面疏水性最高分别为77.63%和76.62%。乳酸菌肠道定植实验结果表明,B2、B8、T20均能稳定地定植在肠道,其中盲肠定植数量显著高于十二指肠,空肠和结肠(P<0.05),与回肠无明显差异。抗菌结果表明,B2、B8、T20均能抑制ETEC 10和A65的生长,细菌培养物和无细胞发酵液(CFS)的抑菌能力无差异。上述实验表明T20菌株具有更好的抑菌活性和耐受性,并且能稳定定植在肠道,证实了T20是一株益生特性优异的益生菌株。选取T20命名Lactobacillus animal 20(L.animal 20),用于下一步体外抗病原菌影响实验。2.乳酸菌L.animal 20体外抗菌影响研究为探究乳酸菌抗肠毒素性大肠杆菌(ETEC 10)和金黄色葡萄球菌A65的作用,从乳酸菌抑制ETEC 10和A65生长的角度出发,选取益生菌株L.animal 20,采用体外共培方法,分析L.animal 20对ETEC 10和A65生长抑制的影响,探究乳酸菌抗病原菌的潜在影响方式。细菌共培养测定表明,ETEC 10和A65在纯培养和共培养中显示出不同的生长方式。L.animal 20能够抑制ETEC 10和A65的生长,共培养中活细胞的数量显著低于纯培养中(P<0.05)。L.animal 20 CFS降低ETEC 10和A65运动性和生物被膜相关基因的表达,并显著降低其运动能力和生物被膜形成能力(P<0.05)。透射电镜(TEM)观察到共培后的ETEC 10和A65的细胞内容物流失,细胞壁收缩,损伤和裂解等现象。SDS-PAGE结果表明处理组ETEC 10和A65的菌体胞内蛋白与对照组相比显著减少(P<0.05)。以上实验结果证明所筛选到的L.animal20对肠毒素性大肠杆菌(ETEC 10)和金黄色葡萄球菌A65具有抑制作用。3.猪源乳酸菌复合制剂的制备及其工艺优化为制备生物活性良好的乳酸菌复合制剂,以复合制剂的抑菌活性为指标,确定T20:B2:B8最适比例为2:2:3。优化发酵培养基组方:0.8%葡萄糖和0.8%蔗糖3:1作为复合碳源;2%豆粕和1%酵母浸粉1:2作为复合氮源;0.01%硫酸铵和0.05%乙酸钠1:1作为缓冲盐;5%番茄和5%黄瓜3:1作为增殖因子。在优化培养基的基础上,分析培养时间、温度、接种量、装液量对乳酸菌复合制剂抗菌活性的影响。结果显示,在2%接种量、40%装液量,于37℃条件下培育18h后,发酵液的抑菌活性最高。综合研究表明,L.animal 20具有良好耐受能力和抗菌活性,并且能够稳定定植在肠道,L.animal 20发酵上清液(CFS)对ETEC 10和A65具有良好的体外抑菌作用;将上述筛选出的乳酸菌制备复合制剂,经过培养基成分以及发酵条件的优化,对ETEC 10和A65的抑菌效果显著提高。本论文研究成果在抗生素替代方面具有一定的应用价值。