论文部分内容阅读
背景Hepcl是主要在肝脏表达的一种小分子抗菌肽,是铁代谢的负调节激素。Hepc1在心脏中少量表达,是一种内在的心脏调节激素,它的表达同样受到低氧和炎症的调节,并与心脏局部铁代谢相关,而且铁是一种重要的参与心脏心脏功能调节的离子。cTnTR92Q转基因小鼠心脏变大,室壁变厚,心腔变小,心肌细胞排列紊乱,间质纤维化,心肌舒张功能失调,而cTnTR141w转基因小鼠的全心扩大,室壁变薄,间质纤维化,心肌收缩功能失调,分别表现出典型的肥厚型和扩张型心肌病病理表型。两种疾病模型动物心脏全基因表达芯片及逆转录PCR结果显示,Hepc1在两种转基因动物模型的心脏中的表达均下调。扩张型心肌病是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩张、心肌收缩功能受损为主要特征的原因不明的心肌疾病,是除冠心病和高血压以外导致心力衰竭的主要病因之一,5年内病死率高达15-50%。本研究的目的是建立心脏组织特异的Hepc1转基因小鼠,探究该基因在扩张型心肌病发生发展中的作用。方法cTnTa141w与cTnTR92Q全基因表达芯片及逆转录PCR检测Hepc1于扩张型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表达变化。RT-PCR法克隆Hepc1基因,将基因插入a-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Hepc1转基因C57/6J小鼠。PCR法鉴定Hepc1转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测基因转录水平,狭缝杂交检测蛋白表达水平,确定高表达首建鼠。Hepc1转基因小鼠与cTnTR141W转基因小鼠杂交建立Hepcl×cTnTR141w杂交小鼠。M型超声心动图检测不同月龄Hepc1、 cTnTR141W及Hepcl×cTnTR141w转基因小鼠心脏的结构形态和功能变化。HE染色和Masson染色观察Hepc1、cTnTR141w及Hepc1×cTnTR141w转基因小鼠心脏组织学改变。透射电镜分析心肌超微结构改变。Western blot检测心脏肥大标记物ATP2A2的表达水平变化；RT-PCR检测Col1al及Acta1的表达。Western blot险测Hepc1、cTnTR141w及Hepcl×cTnTR141w转基因小鼠心脏中p-ERK及ERK表达水平。将Hepc1基因插入CMV启动子下游构建CMV-Hepc1表达载体,脂质体转染法转染H9c2细胞建立过表达CMV-Hepc1稳转细胞系。分别用DFO及FAC对H9c2细胞进行铁剥夺和对CMV-Hepc1稳转细胞系铁增强试验,Western blot检测各细胞系中p-ERK及ERK表达水平变化。结果cTnTR141w与cTnTR92Q全基因表达芯片及逆转录PCR显示,Hepc1在两种转基因小鼠心脏中均表达下降。建立了2个心脏特异表达的Hepc1转基因小鼠品系。Hepc1基因在心脏组织的表达水平超过内源性Hepc1的3倍。同时建立了心脏特异表达的Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠。M型超声心动图及心脏组织学显示,心脏特异表达的Hepc1转基因小鼠的心室室壁增厚,心腔变小,心功能增强；组织学结果显示,心肌细胞排列发生轻度重塑,其余结构未见异常；电镜超微结构可见,心肌纤维增粗,偶见巨大线粒体。与cTnTR141W转基因小鼠相比,Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠心室室壁增厚,心腔变小,心收缩功能明显改善。超微结构可见,Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠心肌肌纤维增粗,肌纤维断裂溶解现象得到明显改善。反映心脏功能的钙调节相关蛋白基因ATP2A2在cTnTR141W转基因小鼠心脏中表达下调,而在Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠心脏中表达增加。反映心肌间质胶原成分的Colla1及细胞骨架相关蛋白Acta1在皆在Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠心脏中表达下调,Hepc1显著逆转了cTnTR141W转基因小鼠心脏中的表达增加。4月龄cTnTR141W转基因小鼠出现早期死亡,至6月龄早期死亡率达16%,Hepc1转基因小鼠未出现早期死亡,而且Hepc1×cTnTR14W转基因小鼠与cTnTR141w转基因小鼠相比,死亡率相对较低。cTnTR141w转基因小鼠心脏中p-ERK水平相对于野生成年小鼠显著下降,而在Hepc1×cTnTR141w杂交小鼠心脏ERK磷酸化水平升高。体外实验表明,铁剥夺时ERK磷酸化水平升高,同时铁剥夺和铁增强时ERK磷酸化水平恢复。结论建立了2个心脏特异表达的Hepc1转基因小鼠品系。Hepc1转基因可明显改善cTnTR141W扩张型心肌病病理表型。Hepc1下调心脏组织中的铁浓度,并诱导ERK激活。这些结果说明Hepc1是通过铁的调节改善扩张性心肌病的病理发展。Hepc1有可能成为治疗心肌病的靶基因之一。背景两种疾病模型动物心脏基因表达芯片结果显示,Lrp2bp在扩张型心肌病动物模型心肌中mRNA显著上调表达,而在肥厚型心肌症动物模型心肌中表达较少,Lrp2bp可能参与心肌病发生发展。建立了心脏特异表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白(Lrp2bp)转基因小鼠,研究该基因在心肌病发病中的作用。方法Western blot检测小鼠Lrp2bp表达谱。克隆鼠源Lrp2bp基因入a-MHC启动子下游构建a-MHC-Lrp2bp表达载体,显微注射法建立Lrp2bp转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blotting鉴定Lrp2bp在心脏中的表达,心脏超声检测转基因鼠及野生型小鼠心脏功能及几何构型,透射电镜观察心肌细胞的超微结构改变。结果Lrp2bp主要在成年小鼠肾脏组织中表达,肝、脾中表达较高,心、肺和脑组织中表达量少,在心脏中的表达不随年龄而改变。得到了4个Lrp2bp转基因品系,其中3个品系心脏Lrp2bp蛋白表达量与同龄野生型鼠相比明显增加。1M龄转基因小鼠与同窝阴性对照小鼠相比,心壁变厚,心腔变大,射血分数和短轴缩短率下降。结论成功建立了心脏特异表达的1rp2bp转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。