论文部分内容阅读
背景虫媒病毒(Arboviruses)是指通过白蛉,蚊,蠓,蜱等吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒。目前虫媒病毒及虫媒病毒病已经成为国际社会关注的热点公共卫生问题。山西省四周山环水绕,地形复杂、日照充足、温度适宜,促成了当地媒介昆虫种类的多样性,白蛉和蚊虫是山西省重要的吸血昆虫媒介。本研究小组2018年报道从中国山西省武乡县采集的白蛉标本中分离出一种新型白蛉病毒属病毒—武乡病毒(Wuxiang virus,WUXV),这是中国首次从自然界采集的白蛉标本中分离到白蛉病毒属病毒,提示由白蛉传播的病毒不仅存在于地中海盆地地区,并已经出现在位于东亚地区的中国大陆。尽管已经在中国自然界采集的白蛉标本中分离到白蛉病毒属病毒,但是当地白蛉的季节消长规律以及白蛉携带病毒是否持续存在等信息尚属不知。另外,蚊虫作为山西省重要的吸血昆虫媒介可能携带多种虫媒病毒,对武乡县当地蚊虫及其携带的虫媒病毒进行调查研究有利于我国虫媒病毒及相关疾病的防控工作。目的本研究小组于2019年在6-8月间在山西省长治市武乡县连续采集白蛉标本和蚊虫标本并开展病毒分离鉴定工作,以明确当地白蛉的季节消长规律以及白蛉携带病毒是否持续存在,并同时探索研究武乡县当地蚊虫携带的虫媒病毒,为当地控制吸血昆虫及其携带病毒的公共卫生危害提供基础数据。方法2019年6月至8月在山西省武乡县两个村庄(陌峪村和前申良沟村)共设置4处固定吸血昆虫标本采集点,即6-8月连续4次的采集工作均在固定采集点进行。每个采集点每次分别设置1盏吸血昆虫采集工具(蚊太太灯)。挂灯采集时间为晚18:00至次日早6:00。采集的所有吸血昆虫标本放在低温冰箱30分钟后取出在冰浴条件下进行标本处理。根据吸血昆虫标本形态,采集时间、采集环境等信息进行分装和编号登记。采集的标本放入液氮保存并通过干冰运输至北京实验室备检。标本研磨、离心,取上清液平行接种BHK-21细胞(金黄色地鼠肾细胞)和C6/36细胞(白纹伊蚊卵细胞)进行病毒分离。细胞病变时收取病毒液使用分子生物学方法对阳性分离物进行鉴定,使用生物学软件对病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析及分子遗传进化分析。结果1.武乡病毒是山西省武乡县白蛉媒介中持续存在的病毒种群2019年6月-8月在山西省武乡县共采集白蛉7466只,其中6月14日、6月26日、7月19日和8月16采集的白蛉数量分别为1835(24.58%)、4465(59.80%)、1136(15.22%)和30(0.40%)。本研究对91批白蛉标本进行病毒分离与鉴定,共获得33株可以引起哺乳动物细胞(BHK-21细胞)病变的武乡病毒分离物。4次采集的白蛉标本中的武乡病毒分离率分别为24%(6/25)、39.22%(20/51)、50%(7/14)、0%(0/1)。2.山西省武乡县采集的骚扰阿蚊中分离出两种弹状病毒2019年6-8月于山西省武乡县共采集到4属4种782只蚊虫标本。其中中华按蚊和骚扰阿蚊为武乡县当地优势蚊种。本研究报道2019年在中国山西省采集的骚扰阿蚊标本中分离到一株可以引起蚊虫细胞(C6/36)病变的病毒分离物(SX1916)。深度测序(NGS)分析发现SX1916分离物中存在两种弹状病毒,其中一种病毒(Shanxi Arboretum virus,SXABTV)基因组序列全长为11480 nt,与弹状病毒科Arboretum virus病毒为同种病毒。另一种病毒(Shanxi Armigeres subalbatus rhabdovirus,SXARV)基因组序列全长为9590nt。对经过空斑纯化获得的SXARV病毒的研究发现,SXARV病毒基因组编码5种蛋白(N、P、M、G和L)外加一个小型疏水蛋白(U1);病毒基因分子遗传进化分析结果显示SXARV属于弹状病毒科Almendravirus Genus病毒;进一步分析发现已知的6种Almendravirus Genus病毒基因组全长在10735nt(Rio Chico virus)-11876nt(Puerto Almendras virus)之间,而SXARV病毒基因组全长仅为9590 nt,是该属病毒中基因组最短的病毒(N和P基因明显变短);SXARV病毒L基因(Rd Rp)与Almendravirus Genus病毒中的巴拿马蚊虫中分离的Rio Chico virus氨基酸同源性最高,仅为63.3%(L基因编码区氨基酸同源性小于90%可以被认为是弹状病毒新种)。综上所述,在中国山西采集的骚扰阿蚊中分离的SXARV病毒为弹状病毒科Almendravirus Genus中新的病毒种。结论2019年6月-8月本研究在中国山西省自然界采集的吸血昆虫标本中分离到多株武乡病毒(中华白蛉)和弹状病毒(骚扰阿蚊)提示:(1)5月份可能是武乡县自然界白蛉的初起时间,6-7月份白蛉的密度高峰期,而终止9月份,提示武乡县白蛉呈全年一世代繁殖特征;(2)不同采集时间均能从当地白蛉中分离到武乡病毒(前提为采集的白蛉数量达到研磨标准),提示武乡病毒是武乡县自然界白蛉媒介中持续存在的病毒种群;(3)在中国山西省采集的SX1916批骚扰阿蚊中存在两种弹状病毒-SXABTV和SXARV,SXABTV与弹状病毒科Almendravirus Genus中的Arboretum virus为同种病毒;SXARV病毒为Almendravirus Genus中新的病毒种;(4)两次空斑纯化实验仅分离出SXARV病毒,鉴于SX1916细胞感染液中存SXARV病毒和SXABTV两种病毒,SXARV的存在是否干扰了SXABTV病毒的空斑形成能力或者SXABTV根本不具备空斑形成能力需要进一步研究探索;(5)SXABTV和SXARV弹状病毒的发现进一步丰富了我们对弹状病毒科Almendravirus Genus病毒的认识。