单分子荧光显微镜是揭示动力学和分子结合的有力工具。但是受光的衍射极限限制，使得大部分单分子实验要求反应物浓度在纳摩尔及以下。而在许多生物和化学反应中，需要反应物浓度在微摩尔或者毫摩尔浓度下进行，例如代谢物、神经递质、酶和催化剂等物质都需在高浓度下进行反应。零模波导是在玻璃基底上镀上一层约为100nm厚的金属薄膜，加工出具有阵列结构的纳米孔器件，孔径为50-150nm，将反应体积控制仄升(zL，10-21 L)级别。零模波导纳米孔的孔径小于光的衍射极限，突破了光的衍射极限，因此可以允许反应物浓度在高浓度下进行观测。此外，由于光无法进入孔内，大大降低了背景荧光。利用零模波导进行单分子荧光检测时，无需核酸等温扩增，实现了真正意义上的单分子检测。本论文利用零模波导芯片，实现单分子荧光检测，具体研究内容如下：
　　(1)以光刻和刻蚀为基础，我们使用负性光刻胶在玻璃基底上加工出孔阵列的抗蚀剂柱子，利用电子束蒸发将靶材金镀在基底上和抗蚀剂柱子顶端，经过氢氟酸刻蚀除去抗蚀剂柱子后获得零模波导芯片。通过扫描电镜SEM表征，我们成功制备了符合要求的零模波导芯片。
　　(2)核酸内切酶Ⅳ(EndoⅣ)的是一种DNA修复酶，可以识别双链DNA的脱嘌呤/嘧啶位点(AP位点)，并对该损伤位点进行切割。EndoⅣ除了用于研究DNA的损伤与修复，还可以用于DNA靶标的信号放大和检测。在第二章中，为了能够观察到由DNA分子结合引起的荧光强度变化，我们基于EndoⅣ的特性设计了目标链和具有AP位点并且使用荧光标记的检测探针。首先将目标链固定在纳米孔底部，目标链与检测探针互补配对形成双链结构，在未加入EndoⅣ时，使用共聚焦激光扫描显微镜可以观察到荧光，对固定有目标链的孔进行定位。加入EndoⅣ后，特异性识别检测探针上的AP位点并进行切割导致荧光消失。此时，再次加入检测探针后，可以观察到荧光重新出现并再次被EndoⅣ切割的现象。实验结果证明，我们可以利用零模波导芯片实现实时单分子荧光检测。
　　(3)KRAS基因突变会导致KRAS蛋白失活，影响细胞通路。胰腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等许多癌症有很大概率是由KRAS基因突变引起的。在第三章中，我们选取KRAS基因密码子12处的基因序列，设计了目标链和具有荧光标记的短链检测探针。短链DNA的结合是不稳定的，因此目标链与检测探针互补配对后产生荧光，结合一定时间后解离导致荧光消失。我们将目标链以单分子的形式固定在芯片底部，随后将零模波导芯片放置在共聚焦激光扫描显微镜载物台上，加入不同浓度的检测探针后，实时监测荧光强度的变化。实验结果证明，我们观察到了单个分子的结合和解离。相比于其他技术，利用零模波导芯片有望实现真正意义上的单分子测序，识别单碱基错配。同时零模波导的纳米孔阵列结构提供了高通量检测的可能性。