荧光成像技术因具有操作简便、高时空分辨率、无损伤检测等诸多优点而受到越来越多的关注。其中，双光子荧光成像技术具有背景荧光低、对生物样品的光损伤小和更深的组织穿透力等优点，从而被广泛应用于细胞、组织和活体成像研究。为了满足各种生物分子的成像检测需要，科研人员开发了大量的功能性荧光染料。然而，由于大部分常见双光子荧光染料存在发射波长短、斯托克斯位移小、并且缺少合适的光学可调控基团等缺点，导致利用它们发展的荧光探针在生物成像应用时面临着信背比不高、灵敏度较低等问题。因此，研发出具有光学性能可控的长波长双光子染料，对高性能“激活型”探针开发及其生物成像分析应用领域具有重要推动作用。针对上述问题，本论文选用具有良好水溶性的花色素(2-苯基苯并吡喃盐)为染料母核，通过分子工程和密度泛函理论(DFT)计算相结合，研发出系列具有羟基可调控基团的长波长双光子荧光染料，在此基础上构建了系列荧光探针，并实现了生物环境中硝基还原酶及pH的高灵敏可视化检测。具体研究内容如下：
　　第一，针对目前常见的双光子荧光染料发射波长短以及缺乏合适的光学可调基团等问题，在课题组前期发展的花色素染料ACF4基础上，我们通过结构优化调节分子平面性和扭曲分子内电荷转移(TICT)程度，并通过“逐步”修饰的方法成功地制备出一种具有光学可调控羟基的多功能长波长荧光团LDOH-4。LDOH-4具有良好的光学性质，如合适的pKa值(5.13)、合适的荧光量子产率(0.55)、较长的吸收与发射波长(λab/λem=574/633nm)、较大的双光子活性吸收截面(89 GM)，并且其荧光强度可以通过羟基的保护与脱保护进行调控，表明LDOH-4在“激活型”荧光探针设计及应用领域具有很好的应用前景。
　　第二，在上述工作基础上，我们选用LDOH-4为双光子荧光报告单元，以对硝基苄基为识别和离去基团，通过羟基的保护与脱保护策略开发了一种硝基还原酶(NTR)激活的双光子荧光探针LDO-NTR。由于该探针分子中的羟基被保护，削弱了氧原子与花色素母核之间的p-π共轭效应，加剧了二甲氨基的TICT效应和识别基团硝基与染料之间的光诱导电子转移(PET)效应，导致探针分子具有极低的背景荧光。LDO-NTR在体外能高敏感地识别NTR(检测限为0.79ng/mL)并使其响应信号大大增强(>310倍)。此外，LDO-NTR不仅能实现缺氧细胞及肿瘤组织中NTR活性的检测，而且还能在乏氧肿瘤小鼠模型体内对NTR活性进行可视化成像。
　　第三，线粒体内pH值呈弱碱性(≈8.0)，其pH的微弱改变将影响其生理功能，但目前缺少高灵敏的荧光探针研究各种生理活动中线粒体内pH的变化。针对该问题，在前期研发的染料LDOH-4基础上，我们进一步通过在羟基邻位引入苯并噻唑基团和调控分子平面性的方式优化其性能，构建了四种新型pH长波长荧光探针。其中，相比其它三种探针，NIR-OH-1具有合适的光学性能，如发射波长处于远红光-近红外区域(λem=656nm)、以及合适的pKa值(7.77，与线粒体pH梯度吻合)、高灵敏pH响应(酸碱响应范围低至1个pH单位附近，荧光响应倍数为12.5倍)，表明该探针适合用于监测线粒体中pH的微弱变化。细胞成像实验结果表明NIR-OH-1能够选择性地点亮细胞线粒体，并能高灵敏的监测羰基氰化物间氯苯腙(CCCP )诱导HeLa细胞线粒体酸化程度，表明NIR-OH-1对各种生理和病理活动中线粒体pH变化的监测具有极大的应用潜力。