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目的:癌症是全球疾病导致死亡的主要原因,严重危害着人类的生命健康。虽然随着社会经济与科技的不断发展,各种检测和治疗手段层出不穷,但癌症的死亡率却没有显著的下降,主要原因是肿瘤极易复发,以及相关治疗药物的副作用较大。因此寻找新的毒性小甚或无毒副作用的肿瘤治疗药物十分重要。姜科植物土田七是一味民族药,在广西少数民族地区使用,常用于治疗跌打损伤,风湿骨痛,月经过多、外伤出血及蛇虫咬伤等;已有研究表明,该药具有良好的抗肿瘤效果,其所含化学成分能够杀伤肝癌细胞。本课题拟采用中药化学分离、纯化与药理实验相结合的方法,筛选出土田七抗肿瘤的活性物质,并阐明其作用机制。方法:1土田七的总提取物及其分离纯化1.1研究土田七的提取方法,探讨不同因素对土田七提取率的影响。1.2对土田七总提取物利用大孔吸附树脂进行分离纯化,得到不同的洗脱部位。利用细胞杀伤实验和荷瘤小鼠对各洗脱部位进行抗肿瘤活性评估。选取活性最优的洗脱部位,再利用硅胶柱层析法进行分离纯化,并进行体外抗肝癌活性筛选。2土田七活性部位抗肿瘤药理作用机制的研究2.1利用不同给药浓度处理肝癌细胞,通过Western-blot检测诱导肝癌细胞凋亡的相关蛋白(cleaved caspase-3、cleaved caspase-9)的表达水平。2.2利用不同给药浓度处理肝癌细胞,通过Western-blot检测内质网应激(ERstress)相关蛋白(GRP78、CHOP)的表达水平,验证土田七提取物是否能激活肝癌细胞的内质网应激(ER stress);利用内质网应激抑制剂(TUDCA),验证是否能够逆转土田七有效部位对肿瘤细胞的杀伤作用。2.3利用不同给药浓度处理肝癌细胞,通过Western-blot检测Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白(GSK-3β、β-catenin)的表达水平,验证土田七提取物是否能抑制Wnt/β-Catenin信号通路。用β-Catenin特异性抑制剂(XAV939)对肝癌细胞进行处理并进行检测,验证抑制Wnt/β-Catenin信号通路是否与诱导肝癌细胞凋亡相关。结果:1土田七的总提取物及其分离纯化1.1比较不同的提取结果表明,用70%乙醇加热回流提取土田七时,提取率最高。1.2抗肿瘤活性实验表明,70%乙醇洗脱部位的抗肿瘤效果最好,95%乙醇洗脱部位次之。对70%乙醇洗脱部位以二氯甲烷-甲醇不同比例混合溶剂进行进一步分离纯化,经体外抗肝癌活性实验证实,二氯甲烷与甲醇比例为2:1时的提取物部位[本文简称为土田七提取物(2:1)部位],抗肿瘤活性最好。2土田七提取物(2:1)部位抗肿瘤药理作用机制的研究2.1通过Western-blot检测内质网应激(ER stress)相关蛋白(GRP78、CHOP)的表达水平,可知土田七提取物(2:1)部位能够激活肝癌细胞的ER stress,上调其相关蛋白GRP78和CHOP的表达水平。内质网应激抑制剂(TUDCA)能够逆转土田七提取物(2:1)部位对细胞增殖和杀伤的作用;检测肝癌细胞中蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平,土田七提取物(2:1)部位能够显著抑制cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达水平,而内质网应激抑制剂(TUDCA)能够逆转这一效应。2.2通过Western-blot检测Wnt/β-Catenin信号通路,可知土田七提取物(2:1)部位能上调肝癌细胞中GSK-3β表达水平并下调β-catenin表达水平,证实土田七提取物(2:1)部位能够抑制Wnt/β-Catenin信号通路,且抑制Wnt/β-Catenin信号通路与诱导肝癌细胞凋亡相关。结论:体外和体内实验均证实土田七乙醇提取物具有良好的抗肝癌细胞的作用,其中主要的抗肿瘤活性物质集中在硅胶柱的二氯甲烷-甲醇(2:1)洗脱部位。土田七提取物(2:1)部位是通过上调肝癌细胞中GSK-3β的水平,促进β-Catenin的降解,从而对Wnt/β-Catenin信号通路起到抑制作用,最终上调凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3、cleaved caspase-9)的表达水平而杀伤肝癌细胞。本课题的研究为阐明土田七抗肿瘤的物质基础及作用机制奠定了基础,为推广土田七的临床抗肿瘤应用提供了科学依据。