第一部分:小鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养、鉴定及探针标记的　　实验研究　　目的:探讨小鼠骨髓来源内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)体外分离培养方法的可重复性，并对培养细胞进行鉴定，掌握钆(Gd)和光学染料的偶联物分子影像探针（bCD-PLL，由复旦大学药学院李聪教授课题组提供）标记EPCs的浓度和时间，为进一步细胞示踪奠定基础。　　材料和方法:采用密度梯度离心法，从C57BL/6L小鼠骨髓中分离出单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)，通过贴壁生长并利用细胞生长因子诱导分化培养获得EPCs，从细胞形态、免疫荧光染色和流式细胞仪分析细胞表面标志物鉴定EPCs。分别将荧光染料罗丹明、近红外染料Cy5.5和磁共振T1对比剂Gd3+-DOTA与多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine)偶联，合成多功能分子探针并标记EPCs.　　结果:密度梯度离心分离小鼠骨髓来源的MNCs培养3d后细胞贴壁生长，培养14d后，细胞呈纺锤形或铺路石样改变。培养14d的MNCs内吞乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)并结合凝集素1(UEA-1)表明该细胞具有内皮特性。细胞免疫荧光染色显示EPCs特异性标志物，其中包括祖细胞或干细胞的表面标志物CD34、CD133和CXCR4，内皮细胞的标志物VEGFR2，vWF，CD146和CD31均呈阳性。流式细胞仪检测显示CD34、CD133和VEGFR2阳性率分别为52.73％、61.63％、14.28％，而内皮细胞的表面标志物CD31的阳性率为3.26％。浓度为2μM的多功能分子探针与EPCs共孵育24小时后，荧光显微镜下观察探针均位于细胞的胞浆内，标记率非常高。　　结论:重复了密度梯度离心法和贴壁诱导分化培养法，该法能够成功分离、培养小鼠骨髓来源EPCs，经大体形态学、免疫荧光染色和流式细胞鉴定，结果表明该细胞具有干细胞和内皮细胞的特性，构建的多功能分子影像探针能够成功标记EPCs，为进一步活体细胞示踪提供实验基础。　　第二部分:小鼠下肢缺血模型的制作及评价　　目的:建立稳定的小鼠下肢缺血模型的操作方法，为进一步活体研究下肢缺血性疾病发病机制及治疗方法提供动物模型。　　材料和方法:电凝法制作裸鼠右侧下肢股动脉缺血模型，并经大体病理学、X线、Micro-CT和彩色多普勒超声、磁共振T2加权成像（T2 weighted Imaging，T2WI）及弥散加权成像（diffusion weighted imgaging，DWI）、近红外激光光谱仪及组织病理学全面评价模型。　　结果:缺血模型制作后，大体病理观察缺血下肢皮肤颜色苍白，X线及Micro-CT均显示动脉中断平面位于股动脉起始处，彩色多普勒超声及近红外激光光谱仪证实缺血肌肉的血流量及血氧饱和度均较正常肌肉显著下降，T2WI显示缺血肌肉水肿呈高信号，T2弛豫时间显著增加;DWI显示缺血肌肉水分子弥散受限，表观弥散系数（Apparent diffusioncoefficient, ADC）值增高。组织病理学显示缺血肌纤维明显肿胀、变圆，肌间隙明显变窄。　　结论:本实验建立稳定的电凝法小鼠下肢缺血模型实验方案，并证实该模型成功构建，为下肢缺血性疾病的进一步研究提供有效的动物模型。　　第三部分:活体示踪多功能分子影像探针标记的内皮祖细胞移植治疗下肢缺血的实验研究　　目的:应用7.0T磁共振和近红外光学成像活体动态观察多功能分子影像探针(bCD-PLL)标记内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)移植治疗小鼠下肢缺血，探讨EPCs在小鼠下肢缺血模型上归巢及迁移过程。　　材料和方法:电凝法成功制作裸鼠右侧下肢缺血模型。小鼠骨髓来源EPCs体外分离、培养14-21d后，分子探针标记细胞。制作成功的下肢缺血模型随机分为三组:模型十移植探针标记的EPCs（实验组Ⅰ）;模型十移植未标记的EPCs（实验组Ⅱ）;模型+生理盐水(实验组Ⅲ)。心内注射移植细胞量为1×106(150μl)。移植前及移植后24h，3d，5d，7d，10d，14d不同时间点进行磁共振成像、近红外光学成像，活体成像结束后处死小鼠，取出下肢肌肉、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行离体光学成像和电感耦合等离子体发射光谱仪(InductivelyCoupled Plasma-Mass Spectrometry, ICP-MS)定量组织中元素Gd含量，免疫荧光染色观察探针标记的EPCs和其表面特异性标志物，进一步评价移植EPCs参与新生血管形成的过程和作用。　　结果:X线、Micro-CT和B型超声显示右侧下肢缺血模型成功建立。活体和离体近红外光学成像显示探针标记的EPCs移植后1、3、5d，实验Ⅰ组右侧下肢光学信号逐渐增强，第7d后逐渐减弱并于第14d消失，磁共振T1WI动态观察下肢肌肉信号强度变化，移植探针标记的EPCs后3d可见下肢肌肉边缘处呈斑片状高信号，7d后信号逐渐减少，动态变化和光学成像结果一致。ICP-MS证实缺血侧肌肉的Gd含量最高峰为移植探针标记后的EPCs第5d。实验Ⅱ组和Ⅲ组未观察到上述变化。免疫荧光染色显示探针标记的EPCs移植后3d下肢肌肉组织微血管中可见CD34、CD133、VEGFR-2、CXCR4与探针中罗丹明呈双阳性细胞。上述结果说明EPCs在移植后3-5d归巢至下肢缺血组织，并参与血管壁形成。近红外成像、MR和ICP-MS也显示大量的探针标记EPCs被肝脏等网状内皮系统吞噬。　　结论:标记有T1WI对比剂Gd3+-DOTA和近红外荧光基团罗丹明和Cy5.5的多功能分子影像探针，能够成功标记EPCs，移植后在活体内同时被MR和近红外光学成像检测，而且探针中荧光基团为离体免疫组织学研究细胞在病变组织的分化提供极大的方便。活体及离体结果均显示标记的EPCs移植后归巢至下肢缺血组织并参与血管形成。　　第四部分:影像评价内皮祖细胞移植治疗小鼠下肢缺血的实验研究　　目的:通过磁共振T2加权成像(T2 weighted Imaging，T2WI)、弥散张量成像(diffusiontensor imaging，DTI)和近红外激光光谱仪动态评价缺血组织结构变化和血氧饱和度的恢复，探讨内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)移植治疗小鼠下肢缺血的疗效。　　方法:制作成功的下肢缺血模型随机分为两组:实验组为分离培养14d小鼠骨髓来源的EPCs心内注射移植入裸鼠右侧下肢缺血模型，移植细胞量为1×106（150μl），对照组为心内注射生理盐水150μl。移植前及移植后24h，3d，7d，14d，21d，28d不同时间点进行7.0T磁共振成像，分别测量缺血下肢水肿范围和程度、肌纤维的数量;同时应用近红外激光光谱仪测量缺血下肢肌肉血氧饱和度。大体病理观察缺血下肢的脱落率。活体检测结束后立即处死小鼠取材并行组织病理学染色和Western Bolt。免疫荧光染色CD31评价组织微血管密度;肌肉组织分别行H&E染色和Massns染色，并通过Image J软件计算存活纤维的相对值，并与磁共振DTI成像测量的纤维数量进行相关分析，比较活体成像的可行性。　　结果: EPCs移植治疗14d后，T2WI显示缺血下肢水肿面积显著小于生理盐水对照组(P＜0.05)，EPCs移植后14及21d，缺血下肢T2弛豫时间显著低于对照组（P＜0．05）。磁共振DTI成像的ADC及FA图显示，EPCs移植治疗7d和14d，缺血下肢ADC值显著低于对照组(P＜0.05)，而FA值较对照组显著增加(P＜0.05)，同时纤维示踪显示EPCs移植治疗28d缺血下肢肌纤维的数量较生理盐水对照组显著改善(P＜0.05)。近红外激光光谱技术显示EPCs移植后14及21d缺血下肢组织血氧饱和度高于对照组(P＜0.05)。大体病理观察EPCs治疗组的下肢脱落率显著低于对照组。免疫荧光染色显示EPCs移植后14d，缺血组织CD31阳性的微血管密度高于对照组(P＜0.05)。Western Blot显示缺血后24h和3d，缺血组织内VEGF、VEGFR2、SDF-1和CXCR4表达量增加，并且EPCs移植治疗组表达量较对照组显著增加。Massons染色显示EPCs移植28d后幸存肌纤维的数量显著高于生理盐水对照组(P＜0.05)，同时胶原及坏死的面积低于对照组。Massons染色半定量幸存纤维和DTI活体纤维示踪结果相关分析显示，两种方法具有相关性（r=0.874，P＜0.05）。H&E染色显示，两组治疗3d后缺血肌细胞均肿胀变圆，治疗28d后对照组细胞间隙中可见大量炎症细胞，EPCs治疗组肌细胞形态恢复，细胞间隙内无炎症细胞浸润。　　结论:活体磁共振成像、近红外激光光谱仪及离体组织学均证实移植骨髓源性EPCs增加缺血肌肉血氧饱和度和毛细血管密度，加速缺血肌肉炎症吸收，并促进缺血后肌纤维恢复。