论文部分内容阅读
随着人类基因组计划的完成,有关个体遗传变异与疾病的关系日益受到重视,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs ）是人类基因组中遗传学变异中最常见的一种类型,也是决定不同个体临床表型多样性的重要因素。因此对复杂性疾病进行SNPs研究对于临床上早期诊断、预防和治疗这类疾病有重要意义。银屑病（俗称牛皮癣）是一种发病率高、易反复、治疗困难的常见皮肤病。尽管一般情况下银屑病不会威胁到患者的生命,却严重影响着患者的生活质量、工作效率和身心健康。以往认为,银屑病的病因和发病机理与遗传、感染、代谢障碍、内分泌、神经精神和免疫等多种因素有关。后有研究发现,环境因素在银屑病的发生和发展过程中也起重要作用。现在一致公认,银屑病是一种由多基因遗传决定、多种环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病。即遗传背景的多样性影响基因功能,在环境因素的作用下,激发机体的细胞免疫应答,产生以CD4+T细胞介导的自身免疫紊乱,从而导致患病。目前,已有研究表明FOXP3基因及其所影响的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞（CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells, Tri-Treg）参与了许多自身免疫性疾病的发病机制。Tri-Treg数量降低,尤其是其与效应性T（effectiveness T Cell, Te）细胞之间免疫失衡,导致Te细胞过度活化,是重型及进展期寻常型银屑病（psoriasis vulgaris, PV）病程发展中的核心环节。近期国内已报道,FOXP3基因中个别SNPs位点与银屑病发病有相关性。但是,对于受多基因影响的复杂性自身免疫性疾病,我们有必要进行大样本、多位点SNPs检测,并在此基础上对FOXP3转录调控进行研究,为机制研究提供更多更可靠的靶向分子。为此,我们选择与免疫性疾病发病密切相关的FOXP3基因,拟在中国PV人群中筛查其SNPs中基因型频率分布,并对阳性关联位点的生物学意义进行初步实验研究。本研究收集408例PV患者及363例正常对照,采用问卷调查,多因素logistic回归分析寻找出与PV发病相关的危险因素。采用聚合酶链式反应-连接酶检测（polymerase chain reaction and ligase detection reaction, PCR-LDR）方法,在中国PV人群中,对FOXP3基因4个SNPs候选位点（rs2232365, rs3761547, rs3761548, rs3761549）进行病例-对照研究。等位基因频率直接由基因型计算,Hardy-Weinberg平衡由χ2检验检测,以P>0.05为符合Hardy-Weinberg平衡,两组间差异由列联表χ2检测,位点间交互作用使用χ2检测,P<0.05为有统计学意义。所有数据的计算使用统计分析系统（version 9.0, SAS Institute Inc, Cary NC）对与PV相关的FOXP3基因阳性SNP位点（rs2232365, rs3761547A, rs3761549）进行初步的功能研究,即通过实时定量-PCR（ realtime- PCR, RT-PCR）法,对比白介素2（Interleukin 2, IL-2）体外刺激前后不同基因型PV患者中FOXP3 mRNA的表达水平,分析不同基因型对FOXP3基因内含子1区中核酸转录的影响。研究主要结果如下:1.本次研究发现,有家族史（p<0.001, OR=3.12, 95% CI= 2.40-4.07）和40岁以前发病（p<0.001,OR= 1.12, 95% CI= 0.92-1.38）仍然是严重影响PV发病的因素;一些环境因素也是PV发病的危险因素:吸烟（ p<0.001, OR =3.91, 95% CI=2.68-5.71）,饮酒（偶尔饮酒: p=0.037, OR=1.46, 95% CI=1.02-2.09;戒酒: p<0.001, OR=5.37, 95% CI=3.21-8.98;继续饮酒: p<0.001, OR=11.90, 95% CI=7.08-19.98）;失业（p=0.0175, OR=3.72, 95% CI=1.26- 10.97）、未婚（p<0.0001, OR=3.93, 95% CI= 2.80-5.52）、睡眠不足（time<5h: p<0.0001, OR=56.61, 95% CI= 13.56 -236.36; 8h>time>5h : p<0.0001, OR= 10.30, 95% CI=7.16-14.82）以及在城市以外的居住地点（p<0.001,郊区: OR=3.72, 95% CI= 2.06-6.72;县城: OR=40.56, 95% CI= 6.27-101.14;农村: OR=26.80, 95% CI= 10.65-67.47）,月经紊乱（p=0, OR=3.88, 95% CI= 1.88-7.92）。2.在408例PV患者及363例正常对照中,采用PCR-LDR对FOXP3基因4个SNP位点（rs2232365,rs3761547,rs3761548,rs3761549）进行分型,结果发现rs2232365,rs3761547和rs3761549等位基因和基因型频率在PV患者及正常对照组中的分布存在显著差异（p值均<0.05）。低频纯合子（低频等位纯合基因型）（rs2232365 GG, rs3761547 GG, rs3761549 TT）是PV发病的保护性基因型,对应高频纯合子是危险基因型。携带保护性基因型的个体患PV危险性将显著降低rs2232365 GG: p=0.0206, adjusted OR= 0.38, 95%CI=0.17-0.86; rs3761547 GG: p=0.0288, adjusted OR=0.30, 95% CI=0.10-0.88; rs3761549 TT: p=0.0399,adjusted OR = 0.33, 95% CI = 0.12- 0.95。3.联合各样本基因型进行分层分析,研究基因多态性与PV临床表型的相关性,结果显示:分别以rs2232365 AA ,rs3761547 AA和rs3761549 CC基因型为参照,多因素Logistic回归分析发现,携带三个与疾病关联位点中rs2232365,rs3761547和rs3761549的G等位、G等位、T等位,可以降低发病年龄<40岁患者的发病率,并可以明显缓解女性群体的发病;三个阳性位点中的低频等位纯合子对有家族史患者发病有降低作用;rs3761547 AG+GG和rs3761549 CT+TT基因型将显著降低不伴有代谢性疾病人群中PV发病风险性。4.本实验发现FOXP3基因的功能性SNP位点rs3761548与PV的发病无相关性。5.对rs2232365 （位点1）,rs3761547 （位点2）和rs3761549 （位点4）进行连锁不平衡分析提示,三个位点存在连锁(分别为D’1,2=0.8794, r2= 0.3927; D’1,4=0.9924, r2= 0.4223; D’2,4=0.9306, r2= 0.9455)。6.对FOXP3基因的多态性位点之间的交互作用进行分析,统计结果显示三个阳性位点之间两两存在交互作用,rs2232365与rs3761547、rs2232365与rs3761549C/T、rs3761547与rs3761549之间的联合型在患者和健康对照之间的分布存在显著差异（p值分别为0.0356, 0.0004和0.0043）。其中FOXP3-rs2232365 AA -3761547 AG+GG联合基因型可增加PV发病危险性2.897倍（校正后p=0.0393, 95%CI =1.05–7.97）,而rs2232365AG+GG-rs3761547AG+GG（p=0.0019, adjusted OR=0.59, 95% CI= 0.42-0.82）、rs2232365AG+GG-rs3761549CT+TT（p=0.0012, adjusted OR=0.57, 95% CI= 0.41-0.80）、rs3761547AG+GG- rs3761549CT+TT （p=0.0027, adjusted OR=0.62, 95% CI= 0.45-0.85）联合基因型显著降低PV发病率,分别提示各位点之间具有联合效应。7.采用配对和非独立样本t检验,对IL-2刺激前后外周血白细胞中FOXP3基因mRNA表达量进行统计学比较,结果发现当等位基因改变时,携带保护型基因患者血中FOXP3 mRNA的表达量明显增高,与FOXP3基因三个阳性关联的SNP位点保护基因型可降低PV患病风险的研究结果一致。综上所述:本研究通过在中国人群中进行病例-对照研究,发现FOXP3基因rs2232365,rs3761547,rs3761549位点多态性与中国人群PV发病相关;三个阳性位点中低频率等位是保护性等位,而高频等位是危险性等位。这三个位点存在连锁, rs2232365 AA - 3761547 AG+GG能显著增加PV患病的风险。FOXP3基因三个阳性位点中高频率等位基因可能是通过下调FOXP3基因的表达而增加了PV发病风险。同时,本实验还发现,伴有家族史和发病年龄在40岁以前是PV发病的危险因素;一些环境因素对PV的发病有密切关系,在城市以外的居住环境下、未婚状态、失业状况女性激素水平紊乱与PV的发病呈正向关,那些吸烟与饮酒者也更易患PV。总之,本研究表明FOXP3基因的SNPs与PV发病相关,该基因的SNP可能通过影响转录水平而导致发病。一些环境因素与PV发病有密切的关联。支持遗传与环境共同作用学说是银屑病重要的发病机理之一。