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目的:四型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)在病原菌致病机制中发挥关键作用,其通过向宿主细胞内分泌多种效应分子,使宿主细胞生理功能失调,导致疾病的发生。为阐明人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis,HGA)的发病机制,本实验应用生物信息学分析,寻找嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,AP)T4SS潜在效应分子,研究其生物学功能,同时鉴定HGA新型诊断抗原,为HGA的诊断、治疗和预防提供重要的新依据。方法:一.嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应分子的筛选、原核表达及抗体制备1.筛选AP T4SS潜在效应分子。以AP基因组编码的610个未知功能蛋白为目标,应用生物信息学技术,根据T4SS效应分子共同特点,筛选潜在的效应分子。2.重组蛋白表达。将筛选获得的APH0177、APH0248、APH0261、APH0615、APH0653、APH0812、APH1127及已鉴定的T4SS效应分子Ats-1为实验对象,按各自基因特征设计引物,以AP基因组DNA为模板进行PCR扩增,并克隆入原核表达载体pET28a(+),进行表达和纯化。同时,另一个筛选获得的效应分子APH0215,经PCR扩增后,将aph0215(90-144)和aph0215(77-144)克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并引入6×His标签,重组质粒转化至表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化。3.抗体制备。将纯化后的蛋白作为免疫原免疫健康ICR小鼠,制备多克隆抗体,免疫印迹方法检测抗体特异性。4.抗APH0215抗体纯化。将aph0215(77-144)克隆至原核表达载体pMAL-c5x,重组质粒转化至表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化,得到MBP-APH0215作为抗原,免疫印迹方法检测抗APH0215抗体的特异性。将纯化的MBP-APH0215蛋白偶联至琼脂糖凝胶,应用亲和层析方法纯化抗APH0215多克隆抗体。二.嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应分子APH0215的氨基酸序列分析及真核表达1.应用生物信息技术预测T4SS潜在效应分子APH0215生物学活性和亚细胞定位等。2.分子克隆。根据aph0215基因序列设计引物,pcr扩增获得目的基因,克隆入真核表达载体pegfp-n1,获得重组质粒aph0215-pegfp。3.转染和显微镜下观察。将aph0215-pegfp转染至hela细胞,在荧光显微镜下观察aph0215-gfp在细胞内的分布及对细胞形态等其他方面造成的影响。三.鉴定人粒细胞无形体病特异性新型诊断抗原1.免疫印迹方法检测ap种属特异性蛋白(aph0177-aph1127及ats-1)的抗原性。2.应用抗原性较强的aph0812与100份人血清样本进行免疫印迹分析,以已知的ap诊断抗原p44为对照,比较两者的敏感性差异。结果:一.嗜吞噬细胞无形体t4ss潜在效应分子的筛选、原核表达及抗体制备1.应用生物信息技术,成功在ap基因组编码的未知功能蛋白中筛选获得35个t4ss潜在效应分子,包括aph0177、aph0215、aph0248、aph0261、aph0615、aph0653、aph0812、aph1127。2.成功将aph0177-aph1127及ats-1基因(aph0215除外)克隆至pet28a(+)原核表达载体,iptg诱导表达,sds-page检测,分别在35.4kda、13.8kda、12.1kda、14.2kda、15.6kda、25.6kda、33.0kda和27.7kda出现明显蛋白诱导条带。将aph0215(90-144)和aph0215(77-144)两条dna片段成功克隆入pgex-4t-1原核表达载体,并引入6×his标签,iptg诱导表达,在33.4kda和32kda处出现明显蛋白诱导条带。3.将上述克隆表达的蛋白用ni琼脂糖亲和层析纯化,免疫小鼠,制备多克隆抗体,经免疫印迹检测显示,制备的抗体可与效应分子特异性结合且效价较高。4.成功构建pmal-aph0215原核表达载体,iptg诱导表达,在49.9kda处出现明显蛋白诱导条带,将其作为抗原检测aph0215抗血清中抗体特异性,免疫印迹结果显示,制备的aph0215抗体可与mbp-aph0215特异性结合。应用琼脂糖凝胶亲和层析法纯化抗aph0215(77-144)抗体,结果显示获得的抗体特异性强且纯度较高。二.嗜吞噬细胞无形体t4ss潜在效应分子aph0215的氨基酸序列分析及真核表达1.生物信息学对aph0215氨基酸序列进行分析,结果显示aph0215主要表达于溶酶体。2.成功构建真核表达载体aph0215-pEGFP,转染至HeLa细胞后在荧光显微镜下观察APH0215-GFP细胞内的分布,结果显示该蛋白聚集成颗粒状,在胞质内散在分布,且细胞形态发生明显改变。三.鉴定人粒细胞无形体病特异性新型诊断抗原1.免疫印迹检测发现APH0653、APH0812和APH1127与AP阳性血清发生强烈的反应,可作为候选HGA诊断抗原。2.免疫印迹检测发现P44和APH0812对人血清中的AP抗体呈现不同的敏感性。结论1.成功构建多个AP T4SS潜在效应分子原核表达载体,并表达和纯化,制备多克隆抗体,并对其中APH0215多克隆抗体进行纯化,为效应分子功能的研究奠定基础和提供重要工具。2.通过aph0215-pEGFP转染HeLa细胞模型,观察APH0215在真核细胞内的分布和对真核细胞形态的影响,为进一步研究APH0215的生物学功能提供依据。3.用获得的多个嗜吞噬细胞无形体种属特异性重组蛋白检测AP阳性标本和临床标本,结果表明APH0812与P44联合使用时可提高人粒细胞无形体病血清学检测灵敏度,为AP新型诊断抗原鉴定提供依据。