论文部分内容阅读
真核生物基因转录如何发生的是生命科学研究领域中需要解答的最基本问题之一。RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）指导的转录起始要求RNA聚合酶Ⅱ、通用转录因子、辅因子和介导子聚集在基因核心启动子区并形成预起始复合物。以前的研究表明,核心启动子TATA box元件上下游存在转录因子ⅡB的识别位点(BREud),BREud突变导致转录因子ⅡA-TATA box binding protein-DNA（TFⅡA-TBP-DNA）复合物的形成明显减少,提示核心启动子区存在TFⅡA结合区并且可能与BREud重叠。本课题的主要研究目标是:1)确定在核心启动子上是否存在TFⅡA识别区域;2)定义TFⅡA识别元件并确定它在Pol Ⅱ指导的基因转录中的作用;3)研究TFⅡA及其识别元件互作如何调节Pol Ⅱ指导的基因转录。传统的体外转录方法是基于放射性同位素标记的引物和引物延伸以及应用于体外转录研究的常规手段。但是,由于放射性的使用,该方法存在诸多缺点,限制了它的广泛应用。因此,在这项课题中,我们首先建立了基于定量PCR和特异性引物延伸的非放射性体外转录新方法。结果表明,体外转录体系中的DNA模板能够被我们研发的手段有效清除至很低的水平。通过设计独特的引物延伸的引物和qPCR引物,引物延伸的产物能被qPCR引物识别和扩增。利用新建立的方法研究TFⅡB下游识别元件突变（BREd）和TFⅡB突变对adenovirus E4（AdE4）和腺病毒晚期启动子（AdML）启动子活性的影响,获得的结果与传统体外转录方法的结果一致。这些结果证明新的体外转录方法能够应用于核心启动子元件对启动子活性的检测以及转录因子介导的启动子转录活性的研究。新方法具有简单和环保等优点,能够被广泛应用于世界范围的转录研究实验室;同时,也为此项课题的完成提供了一个方便的实验手段。如上所述,核心启动子区BREud突变严重影响TFⅡA-TBP-DNA复合物形成,提示TFⅡA与启动子结合区域BREud序列存在重叠。为进一步确定TFⅡA与启动子DNA的具体结合区域,利用纯化的人天然TFⅡA蛋白和AdML启动子DNA完成EMSA和甲基化干扰实验,结果表明,TFⅡA与AdML启动子TATA box上游存在结合位点。利用这一信息,针对TFⅡA结合位点合成含随机碱基的AdML DNA文库并完成SELEX实验,利用随机筛选获得的结果我们定义了位于TATA box上游的TFⅡA的识别元件（ⅡARE）。在这一识别序列两端,TFⅡA更倾向于结合含G或T碱基的DNA序列。利用天然启动子数据库分析表明,ⅡARE存在于许多天然启动子中。为证明我们获得的ⅡARE共同碱基序列是否影响TFⅡA与DNA的结合以及启动子转录活性,我们利用含ⅡARE和不含ⅡARE的启动子进行蛋白-DNA结合实验、体外转录和荧光素酶活性检测实验。实验结果表明,ⅡARE能促进TFⅡA在含TATA box启动子上的结合和含TATA box启动子的基因转录活性;但ⅡARE抑制无TATA box启动子的转录活性。利用整合了ⅡARE优化型和缺陷型AdML启动子的Flp-In293细胞系完成ChIP实验,结果发现ⅡARE是通过增加Pol Ⅱ、TFⅡA、TAF4和p300因子在含TATA box启动子上的招募从而调节转录的,但是,ⅡARE通过减少Pol Ⅱ和TAF1因子在无TATA box启动子上的招募从而抑制转录。为了明白TFⅡA与ⅡARE之间的互作对Pol Ⅱ转录起始组装和转录活性的影响,分别突变ⅡARE以及TFⅡAα/β与ⅡARE结合的潜在位点并完成蛋白-DNA结合实验,结果表明,ⅡARE突变影响TFⅡA与AdML启动子DNA结合,而TFⅡAα/β第348和350位氨基酸突变也明显影响TFⅡAα/β与AdML启动子结合。体外转录和荧光素酶活性检测实验研究表明,TFⅡAα/β第348和350位氨基酸突变（2SM）抑制AdML启动子和天然启动子的活性,这些结果提示TFⅡAα/β可能通过Arg348和Arg350与含ⅡARE启动子DNA结合参与调控Pol Ⅱ指导的基因转录。利用沉默内源TFⅡAα/β并稳定表达外源HA-TFⅡAα/β或其2SM突变的293T细胞系完成ChIP实验,结果表明,表达TFⅡAα/β突变体（2SM）抑制TFⅡA、TBP、p300和Pol Ⅱ在含ⅡARE启动子上的招募,提示TFⅡAα/β突变通过减少这些因子在启动子上的结合从而抑制启动子转录活性。这些结果说明阻断TFⅡAα/β与ⅡARE之间的互作能够抑制TFⅡA-TBP-DNA复合物形成和Pol Ⅱ指导的基因转录。综上所述,在此课题研究中,我们建立了非同位素体外转录新方法。利用该方法以及其他的分子生物学手段研究TFⅡA及其识别元件在Pol Ⅱ指导的基因转录中的调控作用,探究了TFⅡA及其识别元件互作对Pol Ⅱ基因转录的影响及其调控机制。本课题的发现拓展了TFⅡA以及核心启动子元件在基础转录中的作用,为Pol Ⅱ介导的基因转录调控机制提供了新的视角。