目的:1.建立主动脉缩窄致慢性心力衰竭小鼠模型（TAC小鼠模型）,利用单细胞测序技术和生信分析技术探索慢性心力衰竭小鼠心脏巨噬细胞的转录景观和异质性,筛选出一群潜在的、与慢性心力衰竭相关的炎症巨噬细胞亚群,探究其来源、表型和功能。在细胞层面,通过建立共培养体系,研究巨噬细胞新亚群对心肌细胞的影响。在动物模型上研究巨噬细胞新亚群对慢性心力衰竭小鼠心脏的作用,并阐述巨噬细胞新亚群在心衰中的作用机制,为慢性心力衰竭提供新的治疗靶点。2.探讨暖心康对慢性心力衰竭小鼠的心功能、心室重构等的影响,并借助计算机手段及分子生物实验,探索益气活血解毒法代表方暖心康对慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群的作用及有效调控成分,为暖心康治疗慢性心力衰竭提供理论依据。方法:一、基于单细胞测序探索慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群（一）建立TAC小鼠模型,假手术（Sham）组为对照组,术后4周采用超声心动图检测小鼠心功能情况,确定TAC小鼠成模。将各组小鼠过量麻醉后,游离心脏,制备单细胞悬液。加入CD45分离抗体,通过流式细胞术分选CD45+细胞。应用10X单细胞测序体系,获取CD45+细胞的单细胞转录组。（二）应用生物信息手段,对细胞转录组数据进行t-SNE降维和k-means聚类分析、应用我们自己建立的细胞特异性基因数据库,并基于基因集富集（GSEA）分析对细胞群进行鉴定,筛选与炎症和心脏损伤相关的巨噬细胞亚群,鉴定了它们的标志物,并通过动物实验进行验证。（三）通过Chip-seq,荧光素酶报告分析及相应生物信息分析和流式细胞术探究CD72高表达心脏巨噬细胞（CD72hi-CMφs）的来源;体外建立共培养体系,分别探究CD72和Rel过表达BMDM对心肌细胞的作用;体内探究Sham和TAC两种不同条件下WT小鼠和Rel-/-小鼠中CD72hi-CMφs水平的变化及对心脏的作用。通过单核细胞移植过表达Rel探究CD72hi-CMφs对心脏的作用。（四）基于小鼠心梗、动脉粥样硬化的单细胞mRNA测序数据,分析CD72hi-CMφs转录组水平,并对慢性心衰患者心脏转录组数据进行了分析。二、基于暖心康筛选调控慢性心力衰竭相关炎症损伤巨噬细胞亚群的有效成分（一）建立TAC小鼠模型,Sham组为对照,对手术后小鼠分别给予生理盐水、暖心康及培哚普利干预,给药6周后采用超声心动图测定小鼠心功能,测量心重比评估心肌肥大的程度,Masson染色法测定心脏心肌纤维化程度,TUNEL染色法测定心肌细胞凋亡程度,荧光定量PCR法测定心肌肥厚标志物（ANP、BNP、β-MHC）、炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF）含量,以此综合评估暖心康对慢性心力衰竭小鼠心脏的影响。（二）基于前期课题组建立的暖心康转录组数据,通过反卷积方法评估暖心康对CD72hi-CMφs的调控作用,并基于富集分析、荧光素酶报告分析预测并验证暖心康调控CD72hi-CMφs的关键靶点。（三）根据同源建模方法构建鼠源c-Rel蛋白晶体模型,通过分子对接预测暖心康调控CD72hi-CMφs的有效小分子。（四）通过CCK8检测不同浓度果糖精氨酸对BMDM活性的影响,在细胞层面研究暖心康小分子果糖精氨酸对CD72hi-Mφs分化的影响,Real-time q PCR测定TNF、IL-1β水平,以此评估果糖精氨酸抗炎作用。结果:一、基于单细胞测序探索慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群（一）确定慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群及其标记物1.与Sham组相比,TAC组的CD45+细胞百分比显著增加（P<0.05）。10X单细胞测序获得来自Sham和TAC组的8223和5652个细胞的转录组信息。2.通过t-SNE降维及k-means聚类,可以识别8个不同的巨噬细胞亚群（cluster1～cluster 8）。其中cluster 4是一群与慢性心衰相关的炎症巨噬细胞,生信分析找到其特异标记物CD72,Pearson相关性分析显示CD72与促炎细胞因子（Tnf、Il1β）、趋化因子（Ccl2、Ccl4）和纤维化因子（Tgfβ1）呈正相关,GO富集分析显示CD72hi-CMφs转录组涉及巨噬细胞趋化性和巨噬细胞迁移两个生物过程。流式结果显示,与Sham组相比,TAC组心脏巨噬细胞的CD72水平升高（P?<?0.05）,与左室射血分数呈负相关（R2=0.1425）。（二）探索慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群的来源1.Pearson相关性分析结果显示CCR2 mRNA水平与CD72水平呈正相关。流式结果显示,在Sham组和TAC组中,CCR2+CMφs中的CD72水平相比CCR2-CMφs中的CD72水平较高（P?<?0.05）。拟时序分析结果显示,随着单核细胞向巨噬细胞的分化,CD72 mRNA水平呈上升趋势。2.拟时序分析、Ch IP-Seq和荧光素酶报告分析显示Rel是诱导CD72hi-CMφs分化的关键转录因子。流式结果显示,具有Rel过表达的BMDM呈现CD72水平升高（P?<?0.05）。移植有Rel过表达骨髓的小鼠CMφs表现出CD72水平的显著增加（P?<?0.05）。此外,在Sham组和TAC组中,与WT小鼠相比,在Rel-/-小鼠中,CCR2+CMφs的水平降低（P?<?0.05）,CD72水平降低（P?<?0.05）。转录组数据结果一致。（三）研究慢性心力衰竭相关炎症巨噬细胞亚群的作用1.与对照组相比,在与Rel过度表达的BMDM共培养的心肌细胞中,心脏负荷标记物（ANP和BNP）和氧化酶（Cybb、Sod2、Gsr和Prdx5）的mRNA水平增加（P?<?0.05）,但与CD72过度表达的BMDM共培养的心肌细胞中没有增加（P?>0.05）。两组MHC mRNA水平均无变化（P?>0.05）。Phalloidin染色结果显示两组心肌细胞大小都没有显著变化（P>0.05）。流式结果显示,与对照组相比,与Rel过度表达的BMDM共培养显著增加心肌细胞的活性氧（ROS）水平（P<0.05）。而与CD72过度表达的BMDM共培养后心肌细胞的ROS水平没有显著变化（P>0.05）。与Rel过度表达的BMDM共培养的心肌细胞的线粒体含量增加（P?<?0.05）,但ATP的产生减少（P?<?0.05）。CD72敲除显著减轻了Rel诱导的ATP减少（P?<?0.05）和细胞凋亡（P?<?0.05）。免疫荧光显示与过表达Rel的BMDM共培养后的心肌细胞线粒体水平下降,溶酶体水平上升。2.在Sham组和TAC组中,流式和反卷积结果显示,Rel-/-小鼠心脏巨噬细胞的CD72水平都低于WT小鼠（P?<?0.05）。在TAC条件下,与WT小鼠相比,Rel敲除改善了压力负荷损伤造成的LVEF下降（P?<?0.05）,心肌细胞凋亡数量减少（P?<?0.05）,心脏MDA水平降低（P?<?0.05）,炎性细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF）水平降低（P?<?0.05）。3.在Sham组和TAC组中,用Rel过表达单核细胞（Rel-Mos）移植的小鼠的心脏巨噬细胞CD72水平高于用载体（Vehicle Mo）移植的小鼠（P?<?0.05）。在TAC条件下,与移植Vehicle Mo小鼠相比,移植Rel-Mo小鼠LVEF显著下降（P?<?0.05）,心肌细胞凋亡数量增加（P?<?0.05）,MDA水平增加（P?<?0.05）,炎性细胞因子（TNF）和单核细胞趋化蛋白-1水平升高（P?<?0.05）。心肌细胞的面积大小没有明显差异（P?>0.05）。4.小鼠心肌梗死、动脉粥样硬化的单细胞转录组结果显示CD72hi-CMφs水平升高。慢性心衰患者心脏转录组数据显示CD72hi-CMφs水平升高（P<0.05）。二、基于暖心康筛选调控慢性心力衰竭相关炎症损伤巨噬细胞亚群的有效成分1.与Sham组比较,模型组小鼠LVEF和LVFS值显著降低（P<0.05）,LVIDd和LVIDs上升（P<0.05）,心脏细胞形态明显增大（P<0.05）,有较多胶原纤维沉积（P<0.05）,细胞凋亡比率明显增高（P<0.05）,炎症因子（IL-6、TNF、IL-1β）升高（P<0.05）。与模型组比较,暖心康、培哚普利治疗后TAC小鼠LVEF和LVFS值升高（P<0.05）,LVIDd和LVIDs降低（P<0.05）;暖心康、培哚普利能明显降低慢性心力衰竭小鼠心脏的心重比（P<0.05）、心肌纤维化程度（P<0.05）、炎症细胞因子水平（P<0.05）。2.反卷积结果显示,TAC组小鼠的CD72hi-CMφs信号较Sham组小鼠升高,而暖心康能够降低CD72hi-CMφs信号。GSEA富集分析结果显示暖心康正向调节Oct1、Sp3、Evi1、Chop、Ahrarnt、Gncf、Thra,负向调节Hsd17b8、Zfp82、Rel,且暖心康对Rel上调基因集的富集分数为-0.397（adjusted P<0.01）,对Rel下调基因集的富集分数为0.649（adjusted P<0.01）。3.基于异物种来源c-Rel晶体结构序列进行同源建模,得到了鼠源c-Rel蛋白结构蛋白,与暖心康的21种有效小分子分别进行分子对接模拟,果糖精氨酸与c-Rel蛋白晶体对接分数最高（Total Score=8.741,Crash=-1.3346,Polar=8.5449）。荧光素酶报告结果显示,果糖精氨酸减少了由CD72启动子驱动的荧光素酶活性（P<0.05）。4.免疫荧光结果显示1mg/m L小鼠心肌细胞的胞浆提取物干预24h后能显著提高BMDM CD72水平（P<0.05）,提示损伤心肌能促进CD72hi-Mφs分化,而100μg/m L果糖精氨酸干预能显著降低CD72hi-Mφs水平（P<0.05）。5.Real-time q PCR结果显示,与空白对照组比较,100μg/m L果糖精氨酸干预24h后,TNF、IL-1β的含量明显下降（P<0.05）。结论:1.骨髓来源的Rel介导的CD72hi-CMφs可引起心脏损伤,并可能在多种心血管疾病中发挥重要作用。2.暖心康小分子成分果糖精氨酸能够抑制CD72hi-CMφs分化过程及相关炎症因子mRNA水平。