帕金森症（Parkinson’s disease, PD）是以脑部黑质中多巴胺能（dopaminergic， DA）神经元变性、丢失和死亡为病理特征的一类神经退行性病变的疾病，患者常常会出现震颤麻痹、姿势僵硬、行动障碍等症状。该病在老年人中发病率较高，有随年龄增长而增加的趋势，是目前仅次于阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease, AD）的第二大神经系统疾病。PD发病病因目前仍不甚清楚，多数学者认为除与年龄高度相关外，长期与环境毒素接触、遗传和神经炎症等也是导致该病的重要相关因素。1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）能够选择性的被多巴胺转运体（DAT）结合，运送至DA神经元，而后通过抑制细胞线粒体复酶I而干扰呼吸链，影响细胞的能量供应，同时产生大量超氧阴离子，这些超氧阴离子和一氧化氮反应生成过氧亚硝酰阴离子，这些物质能够产生过度氧化应激而严重损伤细胞导致其死亡。谷氨酸（glutamate, Glu）作为一种极其重要的神经递质，过量后能够抑制内源性谷胱甘肽的合成，并伴随活性氧簇（reactive oxigen spieces, ROS）大量堆积而导致细胞死亡。LPS是一种强烈的炎症诱导因子，能够激活神经胶质细胞，释放NO，PGE2等多种炎症因子，使细胞处于过度应激状态，最终导致死亡。三种物质经常用来制备DA神经受损模型进行PD病理和药物研究。1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）是MPP+的前体物质，能够造成灵长类动物的PD症状，最初是在美国吸毒青年中发现。MPTP本身不具有毒性，高度的亲脂性使其很容易通过血脑屏障而进入大脑，在星形胶质细胞中被单胺氧化酶（MAO-B）转化为毒性形式MPP+而对DA神经元造成损害，出现PD症状，作用机制与MPP+细胞损伤模型一致。MPTP是最为常用的致急性PD动物模型药物。　　 大花罗布麻叶是传统的降压中药，同时还具有延缓衰老和增强机体免疫力的活性。化学成分分析表明其中黄酮类成分含量较高，以槲皮素及其苷类为代表成分，研究报道槲皮素等黄酮类物质具有神经保护作用。近期在对罗布麻抗抑郁作用机制研究中发现，罗布麻叶水提取物能够影响多巴胺、5-羟色胺等神经递质的分泌。罗布麻与大花罗布麻叶具有类似的化学成分和药理活性，但对大花罗布麻并未进行过神经系统方面的系统研究。本课题拟对大花罗布麻叶水提取物中的黄酮类化学成分进行分离鉴定，并研究其对DA神经细胞的保护作用，对大花罗布麻的药理活性进行新的探索研究，为PD的中药治疗积累研究资料。　　 1．大花罗布麻叶水提取物黄酮类化学成分分离鉴定和含量测定目的：分离大花罗布麻叶水提取物中黄酮类化学成分，鉴定化学结构；以分离得到的单体化合物作为对照品，测定它们在大花罗布麻叶原药材（E0）、罗布麻霜（E1）、大花罗布麻叶黄酮富集物（E2）中的含量。方法：大花罗布麻叶3kg加水煎煮提取2次，依次加入10、8倍水量，合并提取液，过滤后减压浓缩至一定体积后，加入95%乙醇至含醇量为20%，过夜沉淀除去少量杂质。取上清液浓缩至无醇味后，通过HPD-100型非极性大孔吸附树脂，以含水乙醇梯度洗脱，收集30%乙醇洗脱物继续通过Sephadex-LH 20柱层析，以含水甲醇洗脱。通过对大花罗布麻叶的水提取物进行系统层析后，经反复分离纯化得到三个黄色单体化合物。以高效液相色谱法对三个化合物分别在大花罗布麻叶原药材（E0）、罗布麻霜（E1，大花罗布麻叶水提取物）、大花罗布麻叶黄酮富集物（E2，由E1通过HPD-100型大孔吸附树脂以30%乙醇洗脱所得）中的含量进行了测定。对于槲皮素的测定采用2005版中国药典规定的盐酸水解后再行测定的方法进行。结果：经过理化性质分析和光谱学确证，参考文献后确认三个单体化合物分别为槲皮素（Q1）、罗布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）。三种物质中的含量测定结果见表1。结论：大花罗布麻叶水提取物中槲皮素-3-O-葡萄糖苷得率最高，大孔树脂结合Sephadex LH-20分离大花罗布麻叶黄酮苷类物质得率高于硅胶柱层析法。大花罗布麻相关药材中游离槲皮素含量很低，加酸水解后测定其在大花罗布麻叶原药材、罗布麻霜、大花罗布麻叶黄酮富集物中含量均不低于0.6%，符合药典要求。　　 2．大花罗布麻叶的抗氧化能力和对MPP+、谷氨酸（glutamte, Glu）和LPS诱导的DA神经损伤的保护作用目的：确证并量化大花罗布麻叶的抗氧化活性；通过小鼠原代中脑神经细胞培养实验，研究从大花罗布麻叶中分离得到的三个单体化合物Q1、Q2、Q3，罗布麻霜（E1）和大花罗布麻叶黄酮富集物（E2），对由MPP+、Glu、LPS诱导的DA神经损伤的保护作用；同时分析可能的作用机制。方法：分别以Fulin-Ciocalteu法进行总酚含量测定，DPPH自由基清除实验和Fe3+还原实验等不同方法对大花罗布麻相关药物的抗氧化能力进行测定。采用罗布麻霜（E1，100、200μg/ml），大花罗布麻叶黄酮富集物（E2，50、100μg/ml）；槲皮素（Q1）、罗布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）三个单体化合物5、10、20和40μM；处理于10DIV生长期的小鼠中脑原代神经细胞48h，免疫组化染色观察上述药物浓度对酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH+）表达阳性细胞DA神经元和神经核阳性（neural nuclei， NeuN+）细胞的影响，分析大花罗布麻叶对小鼠中脑神经细胞的作用。同时分别以MPP+（10μM，48h），Glu（500μM，10min），LPS（150μg/ml，48h）三种物质为诱导剂，处理相同培养期（10DIV）的小鼠中脑原代神经细胞；以前述大花罗布麻相关药物浓度对由MPP+，Glu，LPS诱导的DA神经损伤进行干预，免疫组化染色观察DA神经元数量和形态的变化，分析大花罗布麻叶对三种物质诱导的DA神经损伤的保护作用。采用Fe3+还原实验测定MPP+诱导DA细胞损伤模型的细胞培养液的总抗氧化能力，分析大花罗布麻相关药物对抗MPP+的作用机制。以Griess试剂测定由LPS诱导DA细胞损伤模型的细胞培养液中NO含量，分析大花罗布麻对抗LPS的作用机制。结果：三种不同的抗氧化实验结果均显示E1和E2以及三个单体化合物都具有显著的抗氧化活性，其中Q1的在单体化合物中活性最强，E2的活性强于E1。小鼠原代中脑神经细胞培养实验结果表明，大花罗布麻叶相关药物在上述浓度下，对DA神经和NeuN+细胞没有细胞毒作用，并能够对DA神经元纤维的生长有一定促进作用。MPP+、Glu和LPS等三种物质对DA神经元具有明显的抑制作用，细胞活度显著下降，细胞存活率约为50%；经与大花罗布麻相关药物共同作用后， DA神经细胞存活率出现不同程度提高。对细胞培养液的总抗氧化实验和NO实验结果表明，大花罗布麻相关药物能提高细胞的总抗氧化能力，并能抑制LPS导致的NO释放量增多。结论：大花罗布麻叶相关药物对小鼠中脑原代神经细胞没有细胞毒作用，可用于相关药理实验；同时对由MPP+，Glu，LPS诱导的DA神经损伤具有保护作用，可能与抗氧化活性和抑制NO等炎症因子释放作用有关。　　 3．大花罗布麻叶对MPTP型PD小鼠的DA神经保护作用目的：以大花罗布麻叶黄酮富集物E2和槲皮素-3-O-槐糖苷为受试药物，研究大花罗布麻叶对MPTP型PD小鼠DA神经的保护作用。方法：取MPTP（30mg/kg体重）作为小鼠（C57/Bl）PD模型制备药物，大花罗布麻叶黄酮富集物（E2，250mg/kg体重），槲皮素-3-O-槐糖苷（Q3，25mg/kg体重）作为干预药物，先期给予干预药物灌胃7天，第8天开始进行模型制备，腹腔注射给药，连续5天，累积给药150mg/kg，同时灌胃给与干预药物；最末一次给药第2天进行行为学参数测定，次日处死动物，分离脑部两侧纹状体进行多巴胺含量测定；取中脑进行石蜡切片，免疫组化染色后观察黑质致密部（Substantia nigra， SN）病理变化和DA神经元数量和形态变化。行为学参数包括小鼠自主活动次数和爬杆实验。结果：MPTP能够显著减少小鼠自主活动次数和延长爬杆时间，降低纹状体中多巴胺含量，黑质中DA神经元数量减少，胶质细胞增多。给予大花罗布麻两个相关药物干预后，Q3组显示出具有对抗MPTP产生的PD样症状，能够改善小鼠的运动能力，增加纹状体中多巴胺含量，同时黑质中受损的神经细胞有所减少，胶质细胞增生程度减轻。而E2组在相同实验条件下，没有显示出明显的保护作用。结论：大花罗布麻叶中分离得到的槲皮素-3-O-槐糖苷对MPTP型PD小鼠的DA神经损伤具有一定的保护作用。　　 本文建立了对大花罗布麻相关药物中槲皮素-3-O-槐糖苷和罗布麻甲素同时测定的HPLC分析方法，结果显示槲皮素-3-O-槐糖苷含量较高。采用大花罗布麻相关药物进行的小鼠原代中脑细胞培养实验结果表明，大花罗布麻没有细胞毒作用，并能够对抗MPP+、Glu和LPS诱导的DA神经损伤，作用机制可能部分源于其抗氧化能力和对NO的抑制作用。在MPTP型PD小鼠DA神经损伤实验中发现，槲皮素-3-O-槐糖苷能够改善动物行为，提高多巴胺在纹状体中含量，减少黑质中DA神经的丢失，对MPTP造成的DA神经损伤具有保护作用。为大花罗布麻的药理研究提供了新的思路，奠定了进一步研究的基础，同时也为抗帕金森病药物的研究积累了实验资料。