副猪嗜血杆菌(Haemophliusparasuis,HPs)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员,主要存在于猪的上呼吸道。HPs为猪的共生菌,健康猪只中也存在。当猪只受到环境刺激、饲养管理条件差或者感染免疫抑制性病原后,会引起猪只的免疫力低下,从而造成HPs病的继发感染。当前暴发该疾病的猪场主要依赖抗生素来控制该病,长期使用抗生素,往往会产生细菌的耐药性。因此,开发切实有效的HPs疫苗对该病的预防和控制具有重要意义。江苏是我国的养殖大省,HPs病流行情况比较复杂。到目前为止,江苏省HPs病流行情况并不清楚,因此,本研究通过对江苏省部分地区的规模化养猪场和散养猪场的病死猪进行流行病学调查,筛选流行菌株作为疫苗候选株,并制备灭活疫苗进行免疫保护效力的研究。将为江苏地区副猪嗜血杆菌病的防控提供流行病学数据,同时为HPs病的控制提供切实可行的思路。具体研究结果报告如下:1.江苏省副猪嗜血杆菌病的流行病学调查2013年～2015年间,江苏的盐城、泰州、连云港、徐州、宿迁、扬州、苏州、南通、淮安等地区,发生疑似副猪嗜血杆菌病的规模化猪场13个,散户猪场97个。从这些猪场共采集317份病料,发病猪只的临床症状主要表现为:消瘦、被毛杂乱、精神沉郁,关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调、咳嗽、声哑、呼吸困难、高烧不退等;剖检典型特征:关节炎,关节腔内积黄色浊液;心包炎,心脏有纤维蛋白渗出物呈绒毛心;胸膜可见纤维蛋白渗出物、胸腔积液、胸腹腔心包积黄色浊液;腹膜炎、心、肝、肺、肠表面可见黄色纤维素覆盖;脑部血管扩张充血、猪死后尸体不僵硬。采用间接血凝试验,对317份病料进行了检测,副猪嗜血杆菌病感染率为11.54%～27.55%,平均感染率为20.50%,说明江苏各地存在HPs病不同程度感染。副猪嗜血杆菌病在猪的各个年龄段均有感染:断奶猪感染率为16.05%、保育猪为23.56%,育肥猪的感染率为10.53%,其它猪为11.11%,感染最严重的是断奶猪与保育猪,不同生长阶段猪的感染率存在显著差异。对患有副猪嗜血杆菌病的阳性病猪进行常规病毒的检测,结果显示,在江苏受检地区存在HPs病与猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)混合感染现象,混合感染率高达30.77%:尤其是与猪圆环病毒(PCV2)混合感染情况严重,混合感染率为26.15%,为江苏地区副猪嗜血杆菌病的防制提供了流行病学数据。2.副猪嗜血杆菌的分离鉴定为了解江苏地区猪场的HPs血清型,对来自江苏地区的13个规模化养猪场、97个散户猪场及扬州大学动物医院门诊病死猪采集样品,进行细菌分离;除此之外,还从扬州某屠宰场采集健康猪的鼻拭子进行细菌分离。将收集样品接种巧克力培养基培养,通过PCR对HPs的16sRNA进行鉴定。并将阳性菌株进行纯化保存。对所有分离株用间接血凝试验进行的血清学分型显示:江苏地区流行的HPs主要是血清4型、血清5型和血清12型,所占比例分别为14.29%、12.98%、和36.36%;另外,未定型菌株18株,占总分离菌株的23.38%,分型菌株占所有菌株的76.62%。表明目前江苏地区广泛流行的HPs血清型为4型、5型、12型,为该地区副猪嗜血杆菌病的防控及疫苗研制奠定了基础。我们对部分发病严重的猪场病料所分离的病原菌进行了药敏实验,结果显示,分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、恩诺沙星、先锋霉素V、复方新诺明、阿奇霉素等药物高度敏感。将敏感药物应用于患病猪场,获得较为理想的效果。3.副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备流行病学调查结果显示,江苏地区HPs优势血清型为4型、5型及12型。分别以当地分离的血清4型、血清5型及血清12型菌株作为候选疫苗菌株。通过体外大量培养,收获后使用浓度为0.3%甲醛于37℃灭活18h。三种菌按1:1:1的比例混合后制备成三价灭活疫苗,其中每种菌的终浓度为2.0×109CFU/mL。三价苗制备完成后,经灭活检测、质量检验(包括性状检验,内毒素检测以及甲醛残留量检测)确定细菌的灭活效果和安全性。最后,将灭活的HPs与高压灭菌的206佐剂按1:1的比例混合后进行乳化,制成三价灭活苗。4.副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的免疫效力对制备的三价灭活苗进行免疫效力评价。50头健康易感仔猪进行如下处理:HPs三价灭活疫苗免疫组(15头仔猪);HPs商品灭活疫苗免疫组(15头仔猪);攻毒对照组(15头仔猪);健康对照组5头仔猪。免疫组通过颈部皮下注射进行免疫,并于首免1个月后加强免疫;二次免疫后2周攻毒,攻毒后持续观察14天。免疫保护试验结果显示,二免后仔猪血清中抗体效价平均在1:16以上,4型菌株的免疫保护率,三价灭活疫苗免疫组与商品疫苗免疫组相当为40%:对5型和12型菌株的免疫保护率,三价灭活疫苗免疫组均为60%;而商品疫苗对5型菌株的保护率为40%,对12型菌株的保护率仅为20%。本研究初步研制的HPs三价灭活疫苗的保护效果优于商品疫苗,对HPs的血清4型、血清5型及血清12型均具有较好的免疫保护能力,对江苏地区相关猪场防制副猪嗜血杆菌病具有重要意义。综上所述,对江苏地区规模化猪场和散养猪场进行了副猪嗜血杆菌病的流行病学调查,结果表明HPs病在江苏省内广泛存在,其优势流行菌株的血清型分别为4型,5型和12型。应用血清4型、血清5型和血清12型菌株成功制备了三价灭活疫苗。对三价灭活疫苗的免疫效力评价结果表明,本实验研制的三价灭活疫苗免疫保护效果明显高于市售商品疫苗,能为免疫猪只提供良好的免疫保护,为江苏地区副猪嗜血杆菌病的流行病学提供数据支持,同时,为该地区副猪嗜血杆菌病疫苗的研发和疫病的预防提供参考。