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背景：
酒精性股骨头坏死(Alcoholic necrosis of the femoral head，ANFH)是最常见的非创伤性股骨头坏死之一，其病理过程尚未完全清楚，目前存在多种学说，包括：骨内高压学说、脂质代谢紊乱学说、脂肪栓塞学说、骨髓基质细胞脂肪分化学说、骨质疏松学说以及骨细胞凋亡学说等。各种学说均有一定的临床和实验支持，但没有任何一种学说能够完全揭示ANFH发生和进展机制。
细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是一种多基因严密调控下的自发性细胞死亡模式，是机体为维持稳态对外部或内部的刺激作出的反应。既往研究证实在ANFH患者骨组织内存在大量的凋亡细胞，凋亡相关蛋白也存在异常表达。凋亡通路主要包括：(1)线粒体凋亡途径；(2)死亡受体途径；(3)内质网应激途径。三条凋亡通路相互独立又密切相关，共同发挥调控作用，但不同凋亡途径参与的凋亡蛋白存在较大差异。
酒精作为一种外界促凋亡因素，对于不同细胞，其诱导细胞凋亡的通路和机制存在差异。酒精诱导肥大细胞凋亡主要通过死亡受体途径和线粒体凋亡途径共同作用。酒精诱导Jurkat细胞凋亡主要通过内源性线粒体凋亡途径，Caspase-9和Cyt-c表达明显增加。酒精在诱导肝细胞凋亡过程中，Caspase-8表达明显增高，Caspase-8主要在死亡受体途径中表达，因此，酒精诱导的肝细胞凋亡中死亡受体途径起主要作用。但截至目前，酒精引起骨细胞凋亡途径及凋亡相关蛋白表达情况需要进一步探讨。
在构成人体骨组织的结构中存在多种细胞，其中成骨细胞是参与骨形成和骨坏死后修复的主要功能细胞，在骨组织的生长发育、骨代谢动态平衡、骨形成、及骨损伤后的重建修复过程中都起重要作用，其凋亡频率决定了成骨细胞和骨细胞数以及骨基质的稳定。因此，酒精诱导的成骨细胞凋亡和增殖功能异常可能在ANFH的发生发展过程中起重要作用。通过对成骨细胞凋亡调节进行研究，有助于进一步解释ANFH的发病机制，为潜在的细胞治疗和药物治疗提供理论依据。
microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，通过与靶mRNA的特异性结合，降解靶mRNA或抑制其翻译，达到对基因转录后水平的调控，己经被认为是多细胞生物基因转录后水平调控的一种普遍方式，广泛参与细胞增殖、凋亡的调控。miRNA在酒精诱导的成骨细胞凋亡过程中的表达和作用需进行深入探讨。
鉴于酒精诱导成骨细胞凋亡的作用以及miRNA对细胞凋亡的调控，本实验拟通过检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12以及Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78的表达情况，探索ANFH患者凋亡相关蛋白的表达情况，推测其主要的凋亡通路。通过成骨细胞体外培养实验，进一步验证酒精诱导成骨细胞凋亡的主要凋亡通路，并进行miRNA基因芯片检测，在差异表达miRNA中进行功能预测，筛选与主要凋亡途径相关的miRNA。最后对miRNA在酒精诱导成骨细胞凋亡过程中的功能进行验证，为从细胞凋亡方面研究酒精性股骨头缺血性坏死的发病机制提供新的思路。
本研究共分为三部分
第一部分：酒精性股骨头坏死患者和股骨颈骨折患者各10例，取股骨头骨组织，检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78在两组患者骨组织之间表达的差异。
第二部分：体外培养成骨细胞(hFOB1.19成骨细胞)系，根据处理不同将其分为酒精处理组与正常对照组，根据IC50值构建酒精性股骨头坏死细胞模型，并观察两组细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78的表达差异，观察其凋亡情况。随后应用基因芯片对两组细胞总RNA进行筛查，获取差异表达miRNA，对差异明显miRNA进行功能预测。
第三部分：根据第二部分筛选结果，双荧光素酶报告实验验证miRNA-5703与Caspase-3的靶向关系。构建过表达miRNA-5703的慢病毒载体，转染成骨细胞hFOB1.19，使其高表达miRNA-5703，观察酒精作用后成骨细胞hFOB1.19的凋亡率，以及凋亡蛋白Caspase-3的表达情况，揭示miRNA-5703在酒精诱导成骨细胞hFOB1.19凋亡过程中的作用及其机制。
第一部分酒精性股骨头坏死患者与股骨颈骨折患者凋亡相关蛋白的表达差异
目的：
观察酒精性股骨头坏死患者和股骨颈骨折患者股骨头骨组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。
方法：
选取2017年1月至2018年1月来我院行全髋关节置换患者20例，其中酒精性股骨头坏死患者患者10例，股骨颈骨折患者10例。手术均由同一位手术经验丰富的教授带领同一组医生完成。取出股骨头后留取约1cm3骨组织待检。常规HE染色，观察形态；TUNEL检测两组细胞凋亡情况；免疫组化半定量检测两组患者间Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。
结果：
1.HE染色可见ANFH患者骨组织中骨细胞减少，脂肪变性。
2.TUNEL示：ANFH患者股骨头骨组织中细胞凋亡较对照组增加(P＜0.05)。
3.免疫组化结果显示:在ANFH患者骨组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L蛋白高表达，与股骨颈骨折患者相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。Bcl-2蛋白在在ANFH患者骨组织中低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L蛋白在ANFH患者股骨头骨组织中高表达。
2.Bcl-2蛋白在ANFH患者股骨头骨组织中低表达。
3.ANFH患者股骨头骨组织中细胞凋亡较对照组增加。
4.ANFH中细胞的凋亡与死亡受体途径、内质网应激途径、线粒体凋亡途径均密切相关。
第二部分酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡相关蛋白的表达及差异表达miRNA的筛选
目的：
观察正常培养hFOB1.19成骨细胞和酒精处理的hFOB1.19成骨细胞中Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Fulllength-Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、Caspase-8、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。通过与正常培养细胞对比，筛选酒精诱导人成骨细胞hFOB1.19凋亡过程中差异表达的miRNA，通过生物信息学软件对其靶基因及其功能进行预测。推测miRNA与凋亡蛋白之间的关系。
方法：
1.应用CCK-8法测定酒精作用于人成骨细胞hFOB1.19的IC50值，确定其最佳凋亡浓度。
2.采用500mmol/L浓度酒精处理hFOB1.19成骨细胞24h，观察酒精处理组细胞与正常培养组细胞细胞形态变化。
3.Westernblot检测酒精处理组和正常培养组细胞中Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Fulllength-Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L、Bcl-2蛋白表达情况。
4.提取两组细胞总RNA，应用基因芯片技术筛查两组细胞差异表达miRNA。
5.应用基因数据库，对miRNA进行生物学分析，对表达差异最显著的miRNA进行靶基因预测，探讨miRNA潜在的作用机制。
结果：
1.酒精作用于人成骨细胞hFOB1.19的IC50值为512.2mmol/L，细胞凋亡率与酒精浓度呈正相关。
2.采用500mmol/L浓度酒精处理成骨细胞hFOB1.1924h后，与正常培养组相比，显微镜下见酒精处理组培养液中漂浮细胞增多，细胞突起减少，细胞出现凋亡。
3.Westernblot检测发现与正常培养组相比，酒精处理组中Cleaved-Caspase-3、Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78蛋白高表达，Fulllength-Caspase-3、Fas-L、Bcl-2蛋白低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；Fulllength-Caspase-9、Fas表达两组间无差异(P＞0.05)。
4.与正常培养组相比，酒精处理组hFOB1.19成骨细胞差异表达miRNA共68个，其中表达显著上调有42个，表达显著下调有26个。利用3个数据库(Targetscan，microRNAorg，pita)共同对差异miRNA进行靶基因预测并取交集，共有2875个靶基因共同存在。
5.在68个差异表达miRNA中，miR-5703差异表达最为显著，基因预测其靶基因之一为Caspase-3。
结论：
1.酒精能够诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡，该作用存在剂量依赖性。
2.线粒体凋亡途径、内质网应激凋亡通路、死亡受体途径可能均参与了酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程。
3.酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程中，与正常细胞相比，多种miRNA均差异化表达，生物学信息分析差异表达miRNA的共同靶基因主要集中在生物过程、细胞成分和分子功能方面。
4.miR-5703的表达上调倍数最为显著，靶基因预测显示Caspase-3为其靶基因之一，miR-5703可能通过Caspase-3调控酒精诱导的细胞凋亡。
第三部分miR-5703对酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡的影响及作用机制
目的：
验证miR-5703和Caspase-3的靶向关系。构建miR-5703稳定高表达载体，进行慢病毒包装，体外转染hFOB1.19成骨细胞，并以其筛选合适的酒精浓度，构建酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡模型，探讨miR-5703过表达对hFOB1.19成骨细胞增殖、凋亡的影响，探索miR-5703在酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程中的作用机制。
方法：
1.CASP3-3’UTR、CASP3-3’UTRM载体构建及鉴定根据TargetScan网站上预测hsa-miR-5703与Caspase-3的靶向关系，设计NheI和XbaI的酶切位点的引物，PCR扩增含有预测结合靶点的CASP3-3’UTR区，使用NheI和XbaI双酶切pmiR-GLO载体，随后和扩增的目的基因以无缝克隆重组，通过质粒转染后，应用PCR扩增筛选，鉴定阳性克隆。同法构建突变型CASP33’UTRM片段载体并鉴定。
2.GTP-miR-5703过表达载体构建及鉴定设计带有EcoRI和NotI的酶切位点的引物，以HEK293细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增miR-5703。EcoRI和NotI双酶切GTP载体，使用CloneExpressⅡOneStepCloningKit将PCR产物克隆在GTP载体上。通过质粒转染后，PCR扩增筛选和鉴定阳性克隆。
3.双荧光素酶活性报告实验将两种不同质粒按照不同组合分为四组：CASP3-3’UTR+NC组(正常Caspase-3组)、CASP3-3’UTRM+NC组(突变Caspase-3组)、CASP3-3’UTRM+miR-5703组(过表达miR-5703的突变Caspase-3组)，CASP3-3’UTR+miR-5703(过表达miR-5703的正常Caspase-3组)，转染HEK293细胞后，检测各组双荧光素酶活性。
4.将GTP-miR-5703转染入HEK293细胞后，包装慢病毒并浓缩纯化，梯度法测定病毒滴度。慢病毒转染hFOB1.19成骨细胞并加入嘌呤霉素筛选，加入500mmol/L浓度的酒精处理，按照处理方法将细胞分为4组：(1)Vector组(正常细胞组)；(2)Vector+miR-5703组(miR-5703过表达细胞组)；(3)Vector+酒精组(酒精处理组)；(4)酒精+miR-5703组(酒精处理过表达miRNA-5703组)。
5.TUNEL法、CCK-8法检测不同处理后四组hFOB1.19成骨细胞的凋亡率和细胞增殖情况。
6.qPCR检测四组miR-5703的表达。Westernblot检测四组细胞Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达情况。
结果：
1.成功构建双荧光素酶报告基因载体、GTP-miR-5703慢病毒载体，经酶切和测序鉴定双荧光素酶报告基因载体、GTP-miR-5703慢病毒载体表达序列正确。
2.双荧光素酶检测各组酶活性，发现与CASP3-3’UTR+NC组、CASP3-3’UTRM+NC组、CASP3-3’UTRM+miR-5703组细胞相比，CASP3-3’UTR+miR-5703组细胞的相对荧光素酶活性明显降低，与其他三组差异有统计学意义，另外三组之间的相对荧光素酶活性变化无统计学意义。
3.miR-5703过表达载体病毒滴度为2×107TU/mL，8μg/ml嘌呤霉素为最佳筛选浓度。
4.TUNEL检测细胞凋亡示：在细胞培养过程中，Vector组也存在极少量凋亡细胞，Vector+miR-5703组细胞凋亡较Vector对照组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。经酒精处理后，Vector+酒精组、miR-5703+酒精组细胞凋亡均明显增加，其中Vector+酒精组细胞凋亡最为显著，与miR-5703+酒精组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
5.CCK-8检测示：酒精明显抑制hFOB1.19成骨细胞活性，Vector+酒精组、miR-5703+酒精组细胞抑制率明显高于Vector对照组和Vector+miR-5703组，差异有统计学意义(P＜0.05)。miR-5703+酒精组细胞抑制率较Vector+酒精组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
6.qPCR检测四组细胞miR-5703表达情况，组间比较差异有统计学意义(P=0.000)，两两比较，miR-5703组明显高于Vector对照组和Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)；miR5703+酒精组明显高于miR-5703组、Vector对照组和Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)。
7.Westernblot检测示：组间比较，Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3表达差异有统计学意义(P=0.000)；两两比较，miR-5703组Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3较Vector对照组降低，差异有统计学意义(P=0.000)；Vector+酒精组Fulllength-Caspase-3蛋白的表达量低于Vector对照组、Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)；miR-5703+酒精组与Vector对照组、miR-5703组细胞相比较，Cleaved-Caspase-3蛋白的表达量明显增加，差异有统计学意义(P=0.000)，但明显低于Vector+酒精组细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白的表达量，差异有统计学意义(P=0.000)。
结论：
1.成功构建miR-5703过表达和双荧光素酶报告基因载体。
2.Caspase-3是miR-5703的靶基因之一。
3.miR-5703过表达抑制酒精诱导的hFOB1.19成骨细胞凋亡。
4.miR-5703通过靶向调控Caspase-3，减少Fulllengh-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3表达量，抑制酒精诱导的hFOB1.19成骨细胞凋亡。
酒精性股骨头坏死(Alcoholic necrosis of the femoral head，ANFH)是最常见的非创伤性股骨头坏死之一，其病理过程尚未完全清楚，目前存在多种学说，包括：骨内高压学说、脂质代谢紊乱学说、脂肪栓塞学说、骨髓基质细胞脂肪分化学说、骨质疏松学说以及骨细胞凋亡学说等。各种学说均有一定的临床和实验支持，但没有任何一种学说能够完全揭示ANFH发生和进展机制。
细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是一种多基因严密调控下的自发性细胞死亡模式，是机体为维持稳态对外部或内部的刺激作出的反应。既往研究证实在ANFH患者骨组织内存在大量的凋亡细胞，凋亡相关蛋白也存在异常表达。凋亡通路主要包括：(1)线粒体凋亡途径；(2)死亡受体途径；(3)内质网应激途径。三条凋亡通路相互独立又密切相关，共同发挥调控作用，但不同凋亡途径参与的凋亡蛋白存在较大差异。
酒精作为一种外界促凋亡因素，对于不同细胞，其诱导细胞凋亡的通路和机制存在差异。酒精诱导肥大细胞凋亡主要通过死亡受体途径和线粒体凋亡途径共同作用。酒精诱导Jurkat细胞凋亡主要通过内源性线粒体凋亡途径，Caspase-9和Cyt-c表达明显增加。酒精在诱导肝细胞凋亡过程中，Caspase-8表达明显增高，Caspase-8主要在死亡受体途径中表达，因此，酒精诱导的肝细胞凋亡中死亡受体途径起主要作用。但截至目前，酒精引起骨细胞凋亡途径及凋亡相关蛋白表达情况需要进一步探讨。
在构成人体骨组织的结构中存在多种细胞，其中成骨细胞是参与骨形成和骨坏死后修复的主要功能细胞，在骨组织的生长发育、骨代谢动态平衡、骨形成、及骨损伤后的重建修复过程中都起重要作用，其凋亡频率决定了成骨细胞和骨细胞数以及骨基质的稳定。因此，酒精诱导的成骨细胞凋亡和增殖功能异常可能在ANFH的发生发展过程中起重要作用。通过对成骨细胞凋亡调节进行研究，有助于进一步解释ANFH的发病机制，为潜在的细胞治疗和药物治疗提供理论依据。
microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，通过与靶mRNA的特异性结合，降解靶mRNA或抑制其翻译，达到对基因转录后水平的调控，己经被认为是多细胞生物基因转录后水平调控的一种普遍方式，广泛参与细胞增殖、凋亡的调控。miRNA在酒精诱导的成骨细胞凋亡过程中的表达和作用需进行深入探讨。
鉴于酒精诱导成骨细胞凋亡的作用以及miRNA对细胞凋亡的调控，本实验拟通过检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12以及Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78的表达情况，探索ANFH患者凋亡相关蛋白的表达情况，推测其主要的凋亡通路。通过成骨细胞体外培养实验，进一步验证酒精诱导成骨细胞凋亡的主要凋亡通路，并进行miRNA基因芯片检测，在差异表达miRNA中进行功能预测，筛选与主要凋亡途径相关的miRNA。最后对miRNA在酒精诱导成骨细胞凋亡过程中的功能进行验证，为从细胞凋亡方面研究酒精性股骨头缺血性坏死的发病机制提供新的思路。
本研究共分为三部分
第一部分：酒精性股骨头坏死患者和股骨颈骨折患者各10例，取股骨头骨组织，检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78在两组患者骨组织之间表达的差异。
第二部分：体外培养成骨细胞(hFOB1.19成骨细胞)系，根据处理不同将其分为酒精处理组与正常对照组，根据IC50值构建酒精性股骨头坏死细胞模型，并观察两组细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78的表达差异，观察其凋亡情况。随后应用基因芯片对两组细胞总RNA进行筛查，获取差异表达miRNA，对差异明显miRNA进行功能预测。
第三部分：根据第二部分筛选结果，双荧光素酶报告实验验证miRNA-5703与Caspase-3的靶向关系。构建过表达miRNA-5703的慢病毒载体，转染成骨细胞hFOB1.19，使其高表达miRNA-5703，观察酒精作用后成骨细胞hFOB1.19的凋亡率，以及凋亡蛋白Caspase-3的表达情况，揭示miRNA-5703在酒精诱导成骨细胞hFOB1.19凋亡过程中的作用及其机制。
第一部分酒精性股骨头坏死患者与股骨颈骨折患者凋亡相关蛋白的表达差异
目的：
观察酒精性股骨头坏死患者和股骨颈骨折患者股骨头骨组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。
方法：
选取2017年1月至2018年1月来我院行全髋关节置换患者20例，其中酒精性股骨头坏死患者患者10例，股骨颈骨折患者10例。手术均由同一位手术经验丰富的教授带领同一组医生完成。取出股骨头后留取约1cm3骨组织待检。常规HE染色，观察形态；TUNEL检测两组细胞凋亡情况；免疫组化半定量检测两组患者间Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。
结果：
1.HE染色可见ANFH患者骨组织中骨细胞减少，脂肪变性。
2.TUNEL示：ANFH患者股骨头骨组织中细胞凋亡较对照组增加(P＜0.05)。
3.免疫组化结果显示:在ANFH患者骨组织中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L蛋白高表达，与股骨颈骨折患者相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。Bcl-2蛋白在在ANFH患者骨组织中低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L蛋白在ANFH患者股骨头骨组织中高表达。
2.Bcl-2蛋白在ANFH患者股骨头骨组织中低表达。
3.ANFH患者股骨头骨组织中细胞凋亡较对照组增加。
4.ANFH中细胞的凋亡与死亡受体途径、内质网应激途径、线粒体凋亡途径均密切相关。
第二部分酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡相关蛋白的表达及差异表达miRNA的筛选
目的：
观察正常培养hFOB1.19成骨细胞和酒精处理的hFOB1.19成骨细胞中Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Fulllength-Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、Caspase-8、Caspase-12、Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、GRP78蛋白表达情况。通过与正常培养细胞对比，筛选酒精诱导人成骨细胞hFOB1.19凋亡过程中差异表达的miRNA，通过生物信息学软件对其靶基因及其功能进行预测。推测miRNA与凋亡蛋白之间的关系。
方法：
1.应用CCK-8法测定酒精作用于人成骨细胞hFOB1.19的IC50值，确定其最佳凋亡浓度。
2.采用500mmol/L浓度酒精处理hFOB1.19成骨细胞24h，观察酒精处理组细胞与正常培养组细胞细胞形态变化。
3.Westernblot检测酒精处理组和正常培养组细胞中Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Fulllength-Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78、Fas、Fas-L、Bcl-2蛋白表达情况。
4.提取两组细胞总RNA，应用基因芯片技术筛查两组细胞差异表达miRNA。
5.应用基因数据库，对miRNA进行生物学分析，对表达差异最显著的miRNA进行靶基因预测，探讨miRNA潜在的作用机制。
结果：
1.酒精作用于人成骨细胞hFOB1.19的IC50值为512.2mmol/L，细胞凋亡率与酒精浓度呈正相关。
2.采用500mmol/L浓度酒精处理成骨细胞hFOB1.1924h后，与正常培养组相比，显微镜下见酒精处理组培养液中漂浮细胞增多，细胞突起减少，细胞出现凋亡。
3.Westernblot检测发现与正常培养组相比，酒精处理组中Cleaved-Caspase-3、Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Caspase-12、Bax、GRP78蛋白高表达，Fulllength-Caspase-3、Fas-L、Bcl-2蛋白低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；Fulllength-Caspase-9、Fas表达两组间无差异(P＞0.05)。
4.与正常培养组相比，酒精处理组hFOB1.19成骨细胞差异表达miRNA共68个，其中表达显著上调有42个，表达显著下调有26个。利用3个数据库(Targetscan，microRNAorg，pita)共同对差异miRNA进行靶基因预测并取交集，共有2875个靶基因共同存在。
5.在68个差异表达miRNA中，miR-5703差异表达最为显著，基因预测其靶基因之一为Caspase-3。
结论：
1.酒精能够诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡，该作用存在剂量依赖性。
2.线粒体凋亡途径、内质网应激凋亡通路、死亡受体途径可能均参与了酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程。
3.酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程中，与正常细胞相比，多种miRNA均差异化表达，生物学信息分析差异表达miRNA的共同靶基因主要集中在生物过程、细胞成分和分子功能方面。
4.miR-5703的表达上调倍数最为显著，靶基因预测显示Caspase-3为其靶基因之一，miR-5703可能通过Caspase-3调控酒精诱导的细胞凋亡。
第三部分miR-5703对酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡的影响及作用机制
目的：
验证miR-5703和Caspase-3的靶向关系。构建miR-5703稳定高表达载体，进行慢病毒包装，体外转染hFOB1.19成骨细胞，并以其筛选合适的酒精浓度，构建酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡模型，探讨miR-5703过表达对hFOB1.19成骨细胞增殖、凋亡的影响，探索miR-5703在酒精诱导hFOB1.19成骨细胞凋亡过程中的作用机制。
方法：
1.CASP3-3’UTR、CASP3-3’UTRM载体构建及鉴定根据TargetScan网站上预测hsa-miR-5703与Caspase-3的靶向关系，设计NheI和XbaI的酶切位点的引物，PCR扩增含有预测结合靶点的CASP3-3’UTR区，使用NheI和XbaI双酶切pmiR-GLO载体，随后和扩增的目的基因以无缝克隆重组，通过质粒转染后，应用PCR扩增筛选，鉴定阳性克隆。同法构建突变型CASP33’UTRM片段载体并鉴定。
2.GTP-miR-5703过表达载体构建及鉴定设计带有EcoRI和NotI的酶切位点的引物，以HEK293细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增miR-5703。EcoRI和NotI双酶切GTP载体，使用CloneExpressⅡOneStepCloningKit将PCR产物克隆在GTP载体上。通过质粒转染后，PCR扩增筛选和鉴定阳性克隆。
3.双荧光素酶活性报告实验将两种不同质粒按照不同组合分为四组：CASP3-3’UTR+NC组(正常Caspase-3组)、CASP3-3’UTRM+NC组(突变Caspase-3组)、CASP3-3’UTRM+miR-5703组(过表达miR-5703的突变Caspase-3组)，CASP3-3’UTR+miR-5703(过表达miR-5703的正常Caspase-3组)，转染HEK293细胞后，检测各组双荧光素酶活性。
4.将GTP-miR-5703转染入HEK293细胞后，包装慢病毒并浓缩纯化，梯度法测定病毒滴度。慢病毒转染hFOB1.19成骨细胞并加入嘌呤霉素筛选，加入500mmol/L浓度的酒精处理，按照处理方法将细胞分为4组：(1)Vector组(正常细胞组)；(2)Vector+miR-5703组(miR-5703过表达细胞组)；(3)Vector+酒精组(酒精处理组)；(4)酒精+miR-5703组(酒精处理过表达miRNA-5703组)。
5.TUNEL法、CCK-8法检测不同处理后四组hFOB1.19成骨细胞的凋亡率和细胞增殖情况。
6.qPCR检测四组miR-5703的表达。Westernblot检测四组细胞Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达情况。
结果：
1.成功构建双荧光素酶报告基因载体、GTP-miR-5703慢病毒载体，经酶切和测序鉴定双荧光素酶报告基因载体、GTP-miR-5703慢病毒载体表达序列正确。
2.双荧光素酶检测各组酶活性，发现与CASP3-3’UTR+NC组、CASP3-3’UTRM+NC组、CASP3-3’UTRM+miR-5703组细胞相比，CASP3-3’UTR+miR-5703组细胞的相对荧光素酶活性明显降低，与其他三组差异有统计学意义，另外三组之间的相对荧光素酶活性变化无统计学意义。
3.miR-5703过表达载体病毒滴度为2×107TU/mL，8μg/ml嘌呤霉素为最佳筛选浓度。
4.TUNEL检测细胞凋亡示：在细胞培养过程中，Vector组也存在极少量凋亡细胞，Vector+miR-5703组细胞凋亡较Vector对照组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。经酒精处理后，Vector+酒精组、miR-5703+酒精组细胞凋亡均明显增加，其中Vector+酒精组细胞凋亡最为显著，与miR-5703+酒精组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
5.CCK-8检测示：酒精明显抑制hFOB1.19成骨细胞活性，Vector+酒精组、miR-5703+酒精组细胞抑制率明显高于Vector对照组和Vector+miR-5703组，差异有统计学意义(P＜0.05)。miR-5703+酒精组细胞抑制率较Vector+酒精组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
6.qPCR检测四组细胞miR-5703表达情况，组间比较差异有统计学意义(P=0.000)，两两比较，miR-5703组明显高于Vector对照组和Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)；miR5703+酒精组明显高于miR-5703组、Vector对照组和Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)。
7.Westernblot检测示：组间比较，Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3表达差异有统计学意义(P=0.000)；两两比较，miR-5703组Fulllength-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3较Vector对照组降低，差异有统计学意义(P=0.000)；Vector+酒精组Fulllength-Caspase-3蛋白的表达量低于Vector对照组、Vector+酒精组，差异有统计学意义(P=0.000)；miR-5703+酒精组与Vector对照组、miR-5703组细胞相比较，Cleaved-Caspase-3蛋白的表达量明显增加，差异有统计学意义(P=0.000)，但明显低于Vector+酒精组细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白的表达量，差异有统计学意义(P=0.000)。
结论：
1.成功构建miR-5703过表达和双荧光素酶报告基因载体。
2.Caspase-3是miR-5703的靶基因之一。
3.miR-5703过表达抑制酒精诱导的hFOB1.19成骨细胞凋亡。
4.miR-5703通过靶向调控Caspase-3，减少Fulllengh-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3表达量，抑制酒精诱导的hFOB1.19成骨细胞凋亡。