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蝗虫是重要的世界性农业害虫,飞蝗Locusta migratoria是蝗虫中导致蝗灾的主要类群。目前,有机磷杀虫剂是害虫防治的主要手段,由于抗药性的增加,防治效果逐渐下降。为了有效控制蝗虫为害,需要研发广谱、高效、环境友好型的杀虫剂。蜕皮是昆虫特有的生物学现象,由于高等生物不存在几丁质,因此几丁质代谢途径成为杀虫剂设计的安全靶标。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase,UAP)是几丁质合成途径的关键酶。本研究以飞蝗为研究对象,首次对飞蝗UAPs基因的序列特征、表达特性及生物学功能开展了系统研究,希望为蝗虫防治提供科学依据。具体研究内容如下: 一、飞蝗UAPs基因的获得及聚类分析 采用生物信息学方法对飞蝗EST和飞蝗转录组数据库全面搜索,得到两条序列均包含UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的保守区。根据已获得的序列设计特异引物进行全长cDNA扩增及测序验证,验证后的两个基因分别命名为LmUAP1和LmUAP2。Lm UAP1全长cDNA序列为1497 bp,开放阅读框为1455 bp,编码484aa,5非编码区(5-UTR)和3非编码区(3-UTR)的序列长度分别为26 bp和16 bp。LmUAP2全长cDNA序列为1519 bp,开放阅读框为1482 bp,编码493 aa,5-UTR和3-UTR的长度分别为30 bp和7 bp。对已知昆虫UAP进行聚类分析,发现昆虫中仅飞蝗L.migratoria和赤拟谷盗Tribolium castaneum有两个UAP基因,且同一物种的两个UAP基因优先相聚,之后与其他昆虫的UAP聚为一起,表明昆虫UAP间有较近的亲缘关系,而与人类、小鼠、酵母等其他物种UAP关系较远。飞蝗两个UAP之间的氨基酸一致度为71%,与目前已知昆虫UAP的氨基酸序列一致度均不超过63%。 二、飞蝗UAPs基因的组织分布和发育表达变化 基于验证获得的飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因cDNA序列设计特异性的表达引物,采用real-time PCR方法对两个UAP基因在飞蝗10个不同组织部位的表达情况进行分析。结果显示:LmUAP1在所选取的飞蝗10个组织部位中均有表达,体表、脂肪体、前肠、马氏管、胃盲囊、肌肉以及气管中表达较高,中肠、后肠和翅中表达相对较低。LmUAP2在脂肪体中表达量最高,并与其他9个组织部位的表达量有显著性差异。LmUAP1在5龄飞蝗幼虫的不同发育天数都有表达,5龄第1、2天表达量最高,第3-6天表达量逐渐下降,蜕皮前的第7天表达量又有所上升;LmUAP2在飞蝗5龄1-7天的表达量没有显著变化。 三、飞蝗UAPs的功能研究 为了进一步研究飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因在飞蝗生长发育过程中所起的作用,采用RNA干扰的方法,将双链RNA体外合成后注射入飞蝗若虫体内,干扰飞蝗UAP的表达来研究该基因的功能。在飞蝗不同发育阶段注射dsLm UAP1,出现了不同的表型。当选择飞蝗2、5龄中期(每个龄期的第三、四天)注射时,注射组均出现蜕皮时间延迟、背部隆起以及表皮变软而不能完成蜕皮等现象;当选择飞蝗2、5龄初期(每个龄期的第一、二天)注射时,注射组均出现四肢无力、不能进食等现象,最终出现死亡。Lm UAP1基因不论是发育龄期的中期还是初期注射,注射后死亡率都高达100%,与注射dsGFP的对照组(5%左右)相比,具有显著性差异。在飞蝗2、5龄初期或中期注射dsLmUAP2,均没有出现可观察的表型,也无致死现象。 本文研究结果阐明了飞蝗两个UAP基因的分子特性及在飞蝗发育过程中的生物学功能,为害虫防治靶基因的筛选及基于RNA干扰的飞蝗防治技术研发提供了理论依据。